Respirační vzplanutí hmyzích fagocytů

Bc. Ondřej Vašíček, Ph.D.

Master's thesis

Respiratory burst of insect phagocytes

Abstract:

Tvorba reaktivních kyslíkových metabolitů (RKM) a reaktivních dusíkových metabolitů (RDM) byla u některých bezobratlých popsána jako důležitý mikrobicidní obranný mechanismus podobně jako u savčích fagocytů. Cílem bylo zjistit, jestli hemocyty larev zavíječe voskového (Galleria mellonella, Lepidoptera) produkují RKM a RDM jako prostředek oxidativního zabíjení invadujících patogenů. Produkce RKM byla měřena jako chemiluminiscence (CL) nestimulované a stimulované (ZP, fMLP, PMA a Ca-I) hemolymfy nebo izolovaných hemocytů v prostředí luminolu. Nebyla prokázána spontánní ani stimulovaná produkce RKM. Další použitá metoda byla fluorescence za využití próby Amplex Red, kterou jsme úspěšně stanovili produkci H2O2 jak v hemolymfě spontánně, tak po aktivaci.. Metoda byla optimalizována na počet buněk ve vzorku, vyzkoušeno bylo několik ředících roztoků s různým složením a pH, kdy nebyla prokázána tak velká důležitost vápenatých a hořečnatých iontů pro průběh reakce jako je tomu u savčích (lidských) fagocytů. Použité koncentrace aktivátorů s různým mechanismem účinku byly nižší než u savců. Pro hemocyty byly použity aktivátory o poloviční koncentraci než pro savčí fagocyty. Nejlepší stimulační účinky měl aktivátor PMA, pak následují aktivátory OZP, fMLP a Ca-I. Optimalizovanou fluorescenční metodou se potvrdilo pozitivní ovlivnění produkce RKM po aplikaci inhibitorů biosyntézy eikosanoidů (indomethacin a phenidone) do potravy larev, obdobně dopadlo měření RDM za použítí Griessova činidla.

Abstract:

The production of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) by hemocytes has been previously considered as an important microbicidal defence mechanism of some invertebrates similarly to vertebrate phagocytes. The aim of my study was to investigate whether hemocytes of Galleria mellonella (Lepidoptera) larvae can produce ROS and RNS as a tool for the oxidative killing of invading pathogens. The production of ROS measured as a luminol enhanced chemiluminiscence (CL) of unstimulated and stimulated (ZP, fMLP, PMA and Ca-I) hemolymph or hemocytes. However, spontaneous as well as the activated generation of ROS remained at the background level. In following experiments fluorescence method with Amplex Red probe was used for successfully determination of H2O2 production in unstimulated hemolymph as well as after activation. Method was optimalized for an amount of cells in sample. Several diluent solutions has been testing with different composition and pH. Ca2+ and Mg2+ ionts are not so important for reaction in insect in comparison to mammalian cells. Concentration of used activators with different mode of action was lower than in mammals. For hemocytes activators with half concentration than for mammalian fagocytes were used. Activator PMA has the best stimulation effect, following activators were OZP, fMLP and Ca-I. Fluorescence method has been provided positive effect on production of ROS after application of eicosanoid biosynthesis inhibitors (indomethacine and phenidone) in feeding experimetns. Analogous results has been measured with RNS by using Griess reagent.

Keywords

Chemiluminiscence, fluorescence, reaktivní kyslíkové metabolity, reaktivní dusíkové metabolity, Amplex Red, hemocyty, leukocyty, indometacin, phenidon.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 4. 6. 2009
• Supervisor: doc. RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Physics / Biophysics