Molekulárně genetická diagnostika Von Willebrandovy choroby

Bc. Petra Nosková

Master's thesis

Molecular diagnostics of Von Willebrand disease

Abstract:

Diagnostika von Willebrandovy choroby způsobené poškozením kvantity či funkce von Willebrandova faktoru účastnícího se koagulace krve je v současnosti zaměřena především na laboratorní diagnostiku, anamnézu a rodinnou historii krvácivých příhod. Molekulární diagnostika je tak stále v rámci České Republiky upozaďována a vzorky zasílány do ciziny, přestože u dědičných krvácivých chorob, jako je hemofilie, je vyhledávání patologických sekvenčních variant zodpovědných za fenotypové projevy již běžnou praxí. Hlavním cílem proto bylo určit, pomocí kterých metod využívaných v běžné molekulárně genetické laboratoři je za současných podmínek nejvhodnější vyšetřovat gen vWF, jejich použití optimalizovat a aplikovat na pacientské vzorky. Dále pak navrhnout vyšetřovací protokol, podle kterého by vlastní analýza jednotlivých vzorků probíhala, vybrat hot spot oblasti charakteristické pro každý z typů von Willebrandovy choroby a seřadit je pro vyšetřovací postup tak, aby šance na nález patologické varianty byla co nejvyšší, ale zároveň byla diagnostika časově i finančně co nejméně náročná. Detekce sekvenčních variant zahrnovala použití metod PCR, sekvenace a MLPA, v rámci kterých bylo otestováno pět vzorků pacientů diagnostikovaných s von Willebrandovou chorobou odlišných typů i klinických dopadů. Kontrolní i pacientská DNA mimo to sloužila k optimalizaci primerů navržených cíleně pro toto vyšetření, jelikož kromě úseku překrývajícího se s pseudogenem vWF doposud neexistují žádné jejich zavedené sekvence. Tyto primery byly následně využity v PCR a sekvenaci. Metody i navrhovaný protokol byly v rámci práce úspěšně zavedeny a připraveny pro aplikaci v běžném laboratorním provozu. U tří z pěti testovaných pacientů byla nalezena kauzální mutace, u čtvrtého pacienta byla odhalena rozsáhlá delece exonů 1-6 a pouze pátý pacient nevykazoval žádné patologické změny v sekvenci genu vWF.

Abstract:

Diagnostics of von Willebrand disease caused by damaged quantitative or functional properties of von Willebrand factor participating in blood clotting is currently focused mainly on laboratory diagnostics, case history and family history of bleeding. In Czech Republic, molecular diagnostics is still being sidelined and samples are sent to foreign countries even though searching for pathological sequence variants responsible for phenotypic manifestation of inherited bleeding disorders such as hemophilia A is already a common practice. Therefore the main aim was to decide with what type of methods used in a regular molecular genetics laboratory it is the most suitable to examine vWF gene in current conditions, optimize their application and use them on patient samples. Then we had to design a protocol of investigation according to which the actual analysis would run, choose hot spot regions characteristic for every type of von Willebrand disease and put them in order for an investigation procedure so that a chance to find a pathological variant would be the highest but the diagnostics would simultaneously be the least demanding as of time and finances. Detection of sequence variants included application of PCR, sequencing and MLPA methods that were used to examine samples of five patients diagnosed with von Willebrand disease of diverse types and clinical manifestations. Control and patient DNA were also used to optimize primers designed directly for this analysis since except the section overlapping with pseudogene vWF there are no existing established sequences of these primers. They were then used for PCR and sequencing. Methods and proposed protocol were successfully implemented within this work and prepared for application in regular laboratory operation. We found causal mutation for three out of five patients, detected a large deletion of exons 1-6 for fourth patient and only fifth patient did not show any pathological changes in sequence of vWF gene.

Keywords

Von Willebrandova choroba, von Willebrandův faktor, molekulární diagnostika, sekvenace, MLPA

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2018
• Supervisor: RNDr. Iveta Valášková, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Medical Genetics and Molecular Diagnostics