Mechanismus interakce DNA-vazebných proteinů – implikace pro kancerogenezi lidských buněk

Bc. Simona Chludilová

Master's thesis

Mechanism of DNA-binding protein interaction - implications for human cell carcinogenesis

Anotácia:

Herpesviry tvoří širokou skupinu obalených DNA virů replikujících svůj genom v jádře buněk hostitele. Virus Epstein-Barrové (EBV) je onkogenním herpetickým virem způsobujícím infekční mononukleózu a nádorová onemocnění. V infikovaných buňkách se EBV vyskytuje ve dvou formách: latentní – skryté, a lytické – produktivní. Virový protein Rta (z angl. Replication and transcription activator) je jedním ze dvou transkripčních faktorů, které způsobují přechod viru z latentní fáze do lytické. Rta specificky rozpoznává a váže DNA sekvenci obsahující RRE (Rta responzivní elementy). Cílem diplomové práce bylo zjistit, zda zkrácená varianta proteinu Rta bude schopna vázat DNA obsahující RRE motiv a pokud ano, tak s jakou afinitou. Vazba Rta na RRE byla studována pomocí kvalitativních a kvantitativních metod jako je gelová retardační analýza, fluorescenční anizotropie a termoforéza. Zároveň byla práce zaměřena na studium a porovnání lokalizace proteinu Rta a jeho zkrácené varianty v lidských buňkách pomocí fluorescenční mikroskopie. Výsledky práce dokazují schopnost zkrácené varianty proteinu Rta vázat DNA obsahující RRE motiv s mikromolární afinitou. Byla úspěšně popsána lokalizace Rta a jeho zkrácené varianty v jádrech hostitelských buněk. Zkrácená varianta proteinu Rta se nachází také v jadércích. Kvalitativní charakterizace vazby zkrácené varianty proteinu Rta na rozpoznávaný RRE motiv a popis lokalizace Rta v buňkách přispívají k porozumění role Rta proteinu v přechodu EBV z latentní fáze do lytické, a mohou být využity při vývoji nových léčebných postupů nemocí způsobených virem EBV.

Abstract:

Herpesviruses comprise a diverse group of enveloped DNA viruses that replicate their genomes in the nucleus of host cells. Epstein-Barr virus (EBV) is an oncogenic herpesvirus that causes infectious mononucleosis and cancer. In infected cells, EBV occurs in two forms: latent – hidden and lytic – productive. The viral protein Rta (Replication and transcription activator) is one of two transcription factors that cause the virus switch from the latent phase to the lytic phase. Rta specifically recognizes and binds the DNA sequence containing RREs (Rta-responsive elements). The main objective of this thesis was to determine whether a truncated variant of the Rta protein can bind DNA comprising the RRE motif and, if so, with what affinity. The binding of Rta to RREs was studied using qualitative and quantitative methods such as gel retardation assay, fluorescence anisotropy, and thermophoresis. Additionally, the work focused on the investigation of Rta localization in human cells by fluorescence microscopy. The results of the work demonstrate that the truncated variant of Rta binds DNA containing RRE motifs with micromolar affinity. Rta and its truncated variant were localized in host cell nucleus. Truncated variant of Rta was also localized in nucleolus. The qualitative characterization of the binding of the Rta protein truncated variant to the commonly recognized RRE motif and the description of Rta localization in cells contribute to the understanding of the role of the Rta protein in the transition of EBV from latent to lytic phase and may be used in the development of new therapies for EBV-induced disease.

Kľúčové slová

herpesvirus, virus Epstein-Barrové, Rta, RRE, interakce protein-DNA, fluprescenční mikroskopie, Epstein-Barr virus, protein-DNA interaction, fluorescence microscopy

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 18. 5. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 6. 2023
• Vedúci: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.
• Oponent: Ing. Blanka Pekárová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry