Úloha repetitívnych sekvencií DNA v evolúcii pohlavných chromozómov rastlín

Mgr. Tomáš Čermák, Ph.D.

Doctoral thesis

The role of repetitive DNA sequences in the evolution of plant sex chromosomes

Abstract:

Pro všechny organizmy s genetickým určením pohlaví je charakteristické hromadění repetitivních sekvencí na nerekombinujícím pohlavním chromozomu. Zvlášť výrazné je na evolučně starých pohlavních chromozomech savců. S cílem objasnit roli repeticí v evoluci pohlavních chromozomů jsme studovali repetitivní sekvence u Silene latifolia, modelového dvoudomého rostlinného druhu s evolučně mladými heteromorfními pohlavními chromozomy. Z genomové knihovny byly izolovány všechny hlavní typy repeticí v genomu S. latifolia a poté bylo sledováno jejich rozložení na chromozomech pomocí fluorescenční in situ hybridizace. Dvě tandemové repetice a dva typy transpozonů byly odlišně rozložené na chromozomu Y než na ostatních chromozomech, což nasvědčuje existenci specifických evolučních procesů formujících chromozom Y. Pomocí RT-PCR byla studována aktivita nejrozšířenějších transponovatelných elementů se zřetelem na rozdíly mezi pohlavími. Bylo zjištěno, že samčí a samičí jedinci exprimují odlišné sekvenční varianty těchto transpozonů. Čtyři hlavní typy transpozonů byly také amplifikovány na mikrodisektovaných chromozomech X, Y a autozomech s cílem analyzovat sekvenční diverzitu chromozomově specifických, pohlavně specificky exprimovaných a genomových kopií. Kromě studia evoluce pohlavních chromozomů jsem v rámci doktorského studia vycestoval na zahraniční stáž, kde jsem se věnoval studiu využití nové DNA vázající proteinové domény pro cílenou modifikaci genů. Transkripci aktivující efektory (angl. transcription activator-like effectors, TALEs) jsou virulenční faktory pocházející z bakterií rodu Xanthomonas spp. parazitujících na rostlinách a vyvolávají onemocnění aktivací specifických rostlinných genů. Na základě nedávno dešifrovaného kódu, podle kterého tyto proteiny rozpoznávají své cílové sekvence v DNA, jsme sestrojili programovatelné místně specifické nukleázy (angl. transcription activator-like effector nucleases, TALENs) zavádějící dvouřetězcové zlomy do předurčených cílových míst v DNA rostlinných buněk a dalších modelových organismů. Také jsme vyvinuli rychlou a účinnou metodu konstrukce nukleáz s programovatelnou specifitou.

Abstract:

The phenomenon of repeat accumulation on the non-recombining sex chromosome is common for all organisms with genetic sex determination, and is especially pronounced on the ancient mammalian sex chromosomes. In order to elucidate their potential role in sex chromosome evolution, repetitive sequences were studied in Silene latifolia, a dioecious model plant species with evolutionarily young heteromorphic sex chromosomes. All major types of repetitive elements in S. latifolia were isolated by screening a shotgun genomic library. Their chromosomal distribution was analyzed by fluorescence in situ hybridization. Two high copy number tandem repeats and two transposons showed distinct distribution patterns on the Y chromosome compared with other chromosomes suggesting that different evolutionary forces are shaping this unique chromosome. The activity of the most frequent transposable elements was studied by RT-PCR, focused on the differences between the sexes. Different sequence variants were found to be expressed in the male and female individuals. Finally, four major transposable elements were amplified on microdissected X and Y chromosomes and autosomes and their sequence divergence from the sex-specifically expressed and genomic copies was analyzed. In addition to the sex chromosome evolution studies, I did an international internship where I studied a new type of DNA binding protein domain for use in gene targeting. Transcription activator-like effectors (TALEs) are virulence agents from the plant pathogen Xanthomonas spp. that trigger the disease by activation of specific disease genes. Based on the recently deciphered code of TALE-DNA target recognition, we constructed custom site-specific TALE nucleases (TALENs) that induced targeted double strand breaks in plant cells and other organisms. We also developed a rapid method for efficient design and assembly of custom TALENs.

Keywords

transponovatelné elementy, tandemové repetice, Silene latifolia, dvoudomé rostliny, pohlavní chromosomy, TAL efektory, cílená mofidikace genů, místně specifické nukleázy transposable elements, tandem repeats, dioecious plants, sex chromosomes, TAL effectors, gene targeting, site-specific nucleases

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 9. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 10. 11. 2011
• Supervisor: doc. RNDr. Eduard Kejnovský, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Lubomír Tomáška, DrSc., Mgr. Karel Říha, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / General and Molecular Genetics