Genomová sekvence T. pallidum DAL-1 a cesta k definici jeho transkriptomu

Bc. Pavol Mikolka

Diplomová práce

Genome sequence T. pallidum DAL-1 and prediction of its transcriptome

Abstract:

Treponema pallidum is the causative agent of syphilis. It is a very special bacterium with many differences from the other microorganisms. Despite the great interest of scientists, the pathogenic mechanisms and the corresponding virulence factors of these bacteria are not known. T. pallidum does not survive outside the mammalian host because of its limited metabolic capacity and a drastically reduced genome information. Comparisons of complete genomes of different T. pallidum strains allow assessment of biological diversity of these pathogens and identify genomic sequences, which are responsible for different level of virulence and pathogenesis. This paper descibes the complete genome sequence of the most virulent strain of the genus Treponema. The strain DAL-1 was isolated by injecting rabbits intratesticularly with amniotic fluid of human patient. DAL-1 replicates extremely well in rabbits, better than the Nichols strain. Complete genome sequence of Treponema pallidum subsp. pallidum strain DAL-1 was determined to be 1 139 971 base pairs long and contains 1 052 predicted coding sequences. Genome was sequenced by combination of pyrosequencing and Solexa sequencing. Several regions were resequenced by Sanger sequencing. The genome of DAL-1 strain was compared to the genome of Nichols strain. 19 single nucleotide polymorfisms were identified, which resulted in changes of the amino acids in the sequences of proteins. Frameshift mutations (insertions or deletions) were found in 8 genes. Inactivation or changed functions of these genes can be therefore expected. Whole genome sequence comparison showed high sequence homology between these two genomes. Most of the differences were localized in tpr genes and genes encoding proteins with predicted membrane localization and with potential' s antigenic properties. Gene expression analysis is another step in characterization of nearby sequenced genomes. New sequencing systems (Solexa, SOLiD) allow whole genome gene expression analysis in a quantitative way. A high-quality mRNA is needed for this study. Bacterial cultures of syphilitic strains of T. pallidum were propagated in the rabbit testes and the RNA was isolated from the bacterial cells. We were unable to confirm high quality of mRNA and therefore sequence analysis of mRNA was postponed.

Abstract:

Treponema pallidum je pôvodca ochorenia - syfilis. Je to veľmi zvláštna baktéria s mnohými rozdielmi od iných mikroorganizmov. Aj napriek veľkému záujmu vedcov, mechanizmy potogenézy a zodpovedajúce faktory virulencie tejto baktérie nie sú známe. T. pallidum nie je schopná prežiť mimo hosťujúci organizmus kvôli obmedzenej metabolickej kapacite a drasticky zníženej genómovej informácii. Porovnanie kompletných genómov rôznych kmeňov T. pallidum umožni posúdiť biologickú rozmanitosť týchto patogénov a identifikuje DNA sekvencie, ktoré sú zodpovedné za rôzne úrovne virulencie a patogenézy. Táto práca prináša informáciu o kompletnej genómovej sekvencii najviruletnejšieho zástupcu rodu Treponema. Kmeň DAL-1 bol izolovaný z plodovej vody ľudského pacienta intratestikulárnou kultiváciou v králikoch. DAL-1 sa veľmi dobre adaptoval na kultiváciu, lepšie než kmeň Nichols. Kompletná sekvencia genómu Treponema pallidum subsp. pallidum kmeň DAL-1 bola stanovená na 1 139 971 párov báz a obsahuje 1 052 predikovaných kódujúcich sekvencií. Genóm bol sekvencovaný kombináciou pyrosekvencovania a Solexa sekvencovania. Niekoľko oblastí bolo resekvencovaných sekvencovaním podľa Sangera. Genóm kmeňa DAL-1 bol porovnaní s genómom kmeňa Nichols. Bolo identifikovaných 19 jednonukleotidových zámen (SNP), ktoré mali vplyv na zmenu aminokyselín v sekvencii proteínov. Posunové mutácie (inzercie alebo delécie) boli zistené v 8 génoch. Môžu byť preto očakávané inaktivácie alebo zmenené funkcie týchto génov. Sekvencia genómu DAL-1 vykazovala vysokú sekvenčnú homológiu v porovnaní s genómom Nichols. Väčšina rozdielov bola lokalizovaná v tpr génoch a génoch kódujúcich proteíny s predikovanou membránovou lokalizáciou a s potenciálnymi antigénnymi vlastnosťami. Analýza génovej expresie je ďalším krokom v charakterizácii príbuzných sekvenovaných genómov. Nové sekvenačné metódy (Solexa, SOLiD) umožňujú analýzu génovej expresie na kvantitativnej úrovni. Na túto analýzu je však potrebná vysokokvalitná mRNA. Bakteriálne kultúry syfilitických kmeňov T. pallidum boli kultivované v králičích semenníkoch a z bakteriálnych buniek bola izolovaná RNA. Nepodarilo sa nám potvrdiť kvalitnú mRNA, a preto sme nepokračovali v ďalšej analýze mRNA.

Klíčová slova

Treponema pallidum, syfilis, kmeň DAL-1, celogenómová sekvencia, analýza transkriptomu, syphilis, strain DAL-1, genome sequence, transcriptome

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 6. 2010
• Vedoucí: prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Obecná biologie