Charakterizace modelů plicních epiteliálních buněk po expozici environmentálními genotoxiny a nádorovými promotery

Mgr. Strapáčová Strapáčová, Ph.D.

Disertační práce

Characterization of lung epithelial cell models after exposure to environmental genotoxins and tumor promoters

Anotace:

Plíce představují významný cíl mnoha chemických karcinogenních látek, jejichž efekty jsou často spojovány s navázáním na aryluhlovodíkový receptor (AhR). Role AhR v procesu nádorové promoce a progrese v plicích nebyla dosud dostatečně popsána. Kromě klasické aktivace AhR po navázání toxických ligandů, jako jsou polychlorované aromatické polutanty a polycyklické aromatické uhlovodíky, a následné indukce detoxikačních enzymů hraje AhR také významnou roli v modulaci mnoha klíčových fyziologických signálních drah. V prezentované práci jsme se zaměřili na studium adaptačních genů souvisejících s aktivací AhR, hodnocení rizika a toxicity vybraných látek dioxinového typu a na roli AhR v regulaci buněčného cyklu, proliferace a epiteliální mesenchymální tranzice (EMT) v plicních buněčných modelech hlodavců a člověka. Jako první jsme určili změny v genové expresi v lidských epiteliálních buňkách A549 po expozici komplexními směsmi polutantů extrahovaných z aerosolových částic PM2,5 z odlišných lokalit. Ačkoliv se odběrová místa lišila v rozsahu a původu znečištění, extrahovatelné organické směsi indukovaly podobné genové profily. Identifikovali jsme řadu deregulovaných genů a drah vedoucích k aktivaci AhR a metabolismu xenobiotik. Na úrovni transkripce jsme nezaznamenali žádnou signifikantní změnu genů zapojených do odpovědi na poškození DNA nebo apoptózu. Také jsme nepozorovali žádný efekt související s přeměnou epiteliálního fenotypu buňky na mesenchymální. Negenotoxické efekty asociované s AhR (indukce AhR-dependentních genů) jsou zřejmě deregulovány při nižších expozicích než efekty genotoxické. Dále jsme porovnali in vitro potence kongenerů polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů, dibenzofuranů a bifenylů indukovat AhR-dependentní odpovědi v druhově odlišných plicních buněčných liniích. Kromě indukce klasických genů kanonické dráhy AhR (CYP1A1, CYP1B1) jsme detekovali indukci dalších méně studovaných genů (TIPARP, AHRR, ALDH3A1). Z výpočtů hodnot EC20, resp. EC50 jsme získali hodnoty relativní efektivní potence (REPs), které nám sloužily pro porovnání s hodnotami toxických ekvivalenčních faktorů (TEFs) stanovenými Světovou zdravotnickou organizací (WHO). Nakonec jsme hladiny vybraných genů stanovili ve vzorcích izolovaných z plic samic potkanů. Při stanovení hodnocení rizika jsme našli druhově odlišnou citlivost plicních buněčných linií a detekovali jsme některé výrazné odchylky od hodnot stanovenými WHO. V poslední studii jsme se zabývali progresí karcinogeneze při dlouhodobé aktivaci AhR modelovým ligandem 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinem (TCDD) a genotoxickým benzo[a]pyrenem (BaP) v lidské plicní buněčné linii A549. Po expozici BaP docházelo ke zpomalení buněčného cyklu, snižovaní buněčné proliferace a k indukci EMT. TCDD zvyšovalo naopak buněčnou proliferaci, ale nebyly detekovány žádné změny související se změnou fenotypu během procesu EMT. Při současné expozici TCDD a inhibitoru buněčné proliferace mitomycinu C jsme pozorovali změny na úrovni EMT. Pro další studium jsme vytvořili buněčnou linii se sníženou expresí proteinu p21 a potvrdili jsme hypotézu, že aktivace AhR a zpomalení buněčného cyklu za současné exprese p21 vede k EMT.

Abstract:

The lungs represent an important target for a large family of chemical carcinogens, whose effects are in many cases mediated via binding on aryl hydrocarbon receptor (AhR). The role of AhR in tumor promotion and progression in lung is not well characterized yet. Besides the canonical AhR activation by ligands such as polychlorinated aromatic pollutants and polycyclic aromatic hydrocarbons with subsequent induction of detoxification enzymes, AhR plays an important role in modulation of many physiological signaling pathways. In this study we focused on adaptive genes related to AhR activation, risk assessment and toxicity of selected dioxin-like compounds and the role of AhR in cell cycle, proliferation and epithelial mesenchymal transition (EMT) in human and rodent lung cell lines. First, we determined changes in gene expression in human epithelial cells A549 after exposure to complex mixtures extracted from airborne particulate matter PM2.5 sampled on different localities. Although the localities differed in both extent and sources of pollution, samples of extractable organic matter induced similar gene expression profiles. We identified a number of deregulated genes and signaling pathways associated with AhR activation and metabolism of xenobiotics. We did not observe any significant changes in expression of genes involved in DNA damage response or apoptosis. We also did not find any effects related to changes from epithelial to mesenchymal phenotype of cells. Non-genotoxic effects associated with AhR (induction of AhR-dependent genes) appear to be deregulated at lower concentrations than genotoxic effects. We also compared in vitro potencies of polychlorinated dibenzo-p-dioxins, dibenzofurans, and biphenyls to induce AhR-dependent responses in lung cells from different species. In addition to the induction of classical genes belonging to the canonical AhR pathway (CYP1A1, CYP1B1), we detected the induction of other novel AhR-dependent genes (TIPARP, AHRR, ALDH3A1). From calculation of EC20, respectively EC50, we obtained values of relative effective potencies (REPs), which were used for comparison with values of toxic equivalency factors (TEFs) established by World Health Organization (WHO). Finally, we determined mRNA levels of selected genes in samples isolated from the lungs of female rats. We found different species-specific lung sensitivity by determination of risk assessment and we detected some significant discrepancies from WHO values. Finally, we examined the progression of carcinogenesis upon long time activation of AhR by its specific ligand 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) and genotoxic benzo[a]pyrene (BaP) in human lung cell line A549. The exposure to BaP induced the cell cycle arrest, decreased cell proliferation, and induction of EMT. In contrast, TCDD increased cell proliferation, but no phenotype changes related to EMT were detected. Nevertheless, after co-exposure to TCDD and cell proliferation inhibitor, mitomycin C, we observed changes associated with EMT. For further study, we developed a cell line with reduced p21 protein expression and confirmed the hypothesis that AhR activation toghether with p21-induced cell cycle delay leads to EMT.

Klíčová slova

AhR, karcinogeneze, dioxinová toxicita, EMT, BaP, genová exprese, genotoxicita, REP

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2022
• Vedoucí: RNDr. Miroslav Machala, CSc.
• Oponent: prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr., prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie