Telomerase RNAs and how to find them: bioinformatics methods paved the way for discoveries

Agata Magdalena Kilar, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Pro objasnění molekulární povahy evolučních změn telomer u rostlin řádu Asparagales byly charakterizovány podjednotky telomerázové RNA (TR) u těchto rostlin. Neobvykle dlouhá repetitivní jednotka telomer u rostlin rodu Allium umožnila identifikovat TR v transkriptomických datech reprezentativních druhů tohoto rodu. Poté byly identifikovány ortologní TR u rostlin rodu Asparagales, které obsahují telomerovou DNA složenou z opakování TTAGGG (lidský typ) nebo TTTAGGG (typ Arabidopsis). TR byly identifikovány také napříč fylogenezí cévnatých rostlin (Tracheophyta), včetně běžných modelových rostlin, plodin a rostlin s neobvyklými telomerami. Obrovská sekvenční heterogenita podjednotek TR komplikovala dosud jejich charakterizaci v širším fylogenetickém rozpětí. Předchozí studie naznačuje, že TR cévnatých rostlin jsou přepisovány RNA polymerázou III (RNAP III) a pod kontrolou promotoru typu 3, podobně jako známé TR nálevníků. Byla navržena nová strategie pro charakterizaci TR v liniích fylogenetické megaskupiny Diaphoretickes, včetně časně divergujících taxonů Viridiplantae a nálevníků. S využitím charakterizace upstream sekvenčního elementu (USE) promotoru typu 3, který je konzervován v řadě malých jaderných RNA (snRNA), a na základě předpokládané minimální templátové oblastí TR jako vyhledávacími prvky, byly identifikovány kandidátní TR ve vybraných genomech Diaphoretickes. Homologní TR byly poté použity k sestavení kovariančních modelů (CM) pro identifikaci TR u vzdálenějších druhů. TR se mezi eukaryoty velmi liší ve velikosti, sekvenci a způsobech biogeneze. Povzbuzeni výsledky předchozího výzkumu jsme se daále zaměřilie na dosud neznámé TR v jednom z největších řádů Animalia - Hymenoptera (Arthropoda), kde předchozí pokusy jiných výzkumníků o identifikaci TR selhaly. Využili jsme vysokého počtu dostupných sekvencí genomů dostupných u tohoto řádu a identifikovali jsme zde TR pomocí kombinace bioinformatických a experimentálních přístupů. Oproti jiným živočišným TR zde byly u blanokřídlého hmyzu nalezeny krátké TR typu snRNA, pravděpodobně přepisované pomocí RNAP III pod kontrolou promotoru typu 3. Tyto výsledky zpochybňují dosud předpokládaný monofyletický původ TR napříč Animalia a ukazují na evoluční změnu typu a biogenezi TR, která byla spojena s divergencí členovců. Zkušenosti s efektivním využitím bioinformatických přístupů pro identifikaci funkčně významných ncRNA o nízké sekvenční homologii byly vtěleny do bioinformatického nástroje GERONIMO. Identifikace konzervovaných genových homologů může být náročná, pokud mají geny variabilní sekvence. Internetové nástroje, jako je BLAST, jsou sice užitečné, ale mohou být neefektivní při provádění homologického vyhledávání v širokém fylogenetickém měřítku. Infernal je flexibilní nástroj, který zdokonaluje strategii homologického vyhledávání tím, že kombinuje zarovnání sekvencí s konsensem sekundární struktury, vyžaduje však pokročilé bioinformatické znalosti pro spuštění a analýzu svých výstupů. K odstranění těchto omezení byl vyvinut GERONIMO, evoluční vyhledávací nástroj, který provádí homologické vyhledávání napříč stovkami genomů plně automatizovaným způsobem. GERONIMO poskytuje souhrnné tabulky a vizualizace pro snadnou analýzu a zahrnuje taxonomický kontext. Ve srovnání s programem Infernal je GERONIMO uživatelsky přívětivější, což z něj činí cenný nástroj pro výzkumné pracovníky. Výstupy práce se počítají na stovky identifikovaných nových TR napříč cévnatými rostlinami, dalšími taxony Diaphoretickes a u blanokřídlého hmyzu. Přítomnost promotorových motivů RNP III typu 3 a konzervovaných strukturních motivů TR zpochybnila dosavadní hypotézy o e

Abstract:

volučním původu TR u rostlin a živočichů. Nově vyvinutý nástroj GERONIMO zpřístupňuje vědcům pokročilé homologické vyhledávání pro účely podobných výzkumů.

Abstract:

To elucidate the molecular nature of evolutionary changes of telomeres in the plant order Asparagales, telomerase RNA subunits (TRs) in these plants were characterised. The unusually long telomere repeat unit in Allium plants allowed the identification of TRs in transcriptomic data of representative species of the Allium genus. Orthologous TRs were then identified in Asparagales plants harbouring telomere DNA composed of TTAGGG (human type) or TTTAGGG (Arabidopsis type) repeats. TRs were also identified across the land plant phylogeny (Tracheophyta), including common model plants, crop plants, and plants with unusual telomeres. The enormous sequence heterogeneity of TR subunits has complicated their characterisation in a broader phylogenetic range. The previous study suggests that land plant TRs are transcribed by RNA polymerase III (RNAP III) and under the control of the type-3 promoter, similar to known ciliate TRs. A novel strategy was designed to characterise TRs in Diaphoretickes lineages, including early diverging Viridiplantae taxa and ciliates. Starting with the characterisation of the Upstream Sequence Element (USE) of the type 3 promoter that is conserved in a number of small nuclear RNAs (snRNAs), and the expected minimum TR template region as search features, candidate TRs were identified in selected Diaphoretickes genomes. Homologous TRs were then used to build covariance models (CMs) to identify TRs in more distant species. TR is highly divergent in size, sequence and biogenesis pathways across eukaryotes. Encouraged by our prior research, we focused on previously unknown TRs in one of the largest Animalia order – Hymenoptera (Arthropoda), where previous attempts of other researchers to identify TRs have failed. We utilized a large number of sequenced genomes available in this order and identified TRs using a combination of bioinformatic and experimental approaches. In contrast to the other animal TRs, short TRs of the snRNA type, likely transcribed with RNAP III under the control of the type 3 promoter, were found in Hymenoptera insects. These results, questioned the as-of-now-assumed monophyletic origin of TRs across Animalia and pointed to an evolutionary switch in TR type and biogenesis associated with the divergence of Arthropods. Experience with the effective use of bioinformatics approaches for the identification of functionally important ncRNAs with a low sequence homology has been incorporated into a bioinformatics tool GERONIMO. Identifying conserved gene homologs can be challenging when genes have variable sequences. While web-based tools like BLAST are helpful, they may be inefficient in performing homology searches on a broad phylogenetic scale. While Infernal (inference of RNA alignments) is a flexible tool that advances the homology searches strategy by combining sequence alignment with a secondary structure consensus, it requires advanced bioinformatical knowledge for running and analysing its outputs. To address these limitations, GERONIMO was developed, an evolutionary search tool that performs homology searches across hundreds of genomes in a fully-automated way. GERONIMO provides summary tables and visualizations for easy analysis and includes taxonomy context. Compared to Infernal, GERONIMO is more user-friendly, making it a valuable tool for researchers. The thesis outcomes are counted in hundreds of identified novel TRs across Tracheophyta, other Diaphoretickes taxa, and Hymenoptera. The presence of RNP III type 3 promoter motifs and TR conserved structural motifs challenged the current hypotheses on TR evolutionary origin in plants and animals. The newly developed tool GERONIMO makes advanced homology searches in similar studies available for scientists.

Keywords

telomeres, telomerase, telomerase RNA, evolutionary origin, Tracheophyta, Diaphoretickes, Arthropoda, homology searches, computational methods, BLAST, Infernal, GERONIMO

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 2. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 24. 3. 2023
• Supervisor: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
• Reader: RNDr. Roman Hobza, Ph.D., doc. Mgr. Aleš Pečinka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics