Molecular biology tools for diagnostics of ongoing remediation

Mgr. Iva Dolinová

Doctoral thesis

Remediation technologies using genetics methods

Abstract:

This thesis focuses on bioremediation, molecular genetic methods and the preparation of nanofibre carriers for actual microbial community sampling. The research was focused exclusively on chlorinated ethenes with severe negative effects on both the environment and human health. The combination of chemical and biological methods, along with application of Fenton's reagent and enhanced reductive dechlorination, are the most common remediation strategies for removal of chlorinated ethenes. In this thesis study, the influence of such techniques on indigenous bacteria was assessed using a wide spectrum of molecular genetic markers, including the 16S rRNA gene, specific chlorinated ethene degraders and reductive dehalogenase genes, together with sulphate-reducing and denitrifying bacteria. Bioremediation was monitored through the level of individual enzymes or bacterial strains. Molecular genetics and hydrochemical tools were also used to evaluate natural attenuation of chlorinated ethenes in a Quaternary alluvial aquifer located close to a historical source of large-scale tetrachloroethylene contamination. Next generation sequencing of the middle and/or lower zones served as a tool for detailed characterisation. The relative abundance of specific degraders was identified using real-time PCR. The combined results confirm the hypothesis that there is significant potential for reductive dechlorination by natural attenuation. At present, sampling and processing of groundwater for DNA analysis is complicated and influenced by transport and filtration in the laboratory. Regular soil sampling is not always possible due to the financial costs and reproducibility. The aim of this research was to develop a system of nanofibre carriers that could be used repeatedly for long-term monitoring of contaminated localities. The newly developed nanofibre carrier displayed non-preferential growth, is small thus easily transportable, and the material meets the requirement for DNA isolation. Long-term testing in situ proved that the nanofibre carriers are more than suitable for molecular genetic analysis. Individual composition and the arrangement of the nanofibre carriers were patented.

Abstract:

Předkládaná dizertační práce řešila dva hlavní cíle. Prvním byl monitoring a hodnocení bioremediačních procesů in situ pomocí molekulárně genetických metod. Druhým cílem byla příprava nanovlákených nosičů biomasy, které by měly sloužit k odběru a izolaci DNA ze vzorků získaných na reálné lokalitě. Výzkum byl cílený na problematiku chlorovaných ethenů patřících mezi nejčastější kontaminanty s prokázaným negativním vlivem na životní prostředí i lidské zdraví. Kombinace chemické a biologické sanace patří k častým strategiím odstranění chlorovaných ethenů. V disertační práci byl zkoumán vliv těchto technik na přítomná bakteriální společenstva pomocí molekulárně genetických metod. Použité markery zahrnovaly 16S rRNA gen specifických degradérů i geny pro reduktivní dehalogenázy. Dále byly testovány markery charakterizující denitrifikační a síru redukující bakterie. Monitoring hladin jednotlivých testovaných markerů dovoloval hodnotit průběh a efektivitu probíhajících sanačních procesů. Metody molekulární genetiky spolu s hydrogeochemickými analýzami byly také použité při hodnocení biologických dějů v kvartérním aluviálním podloží nacházejícím se v blízkosti historického zdroje rozsáhlé kontaminace tetrachlorethylenem. Relativní hladiny specifických degradérů byly měřené metodou polymerázové řetězové reakce v reálném čase (real-time PCR). Detailní charakterizace zkoumané lokality, respektive autochtonní mikroflóry, byla prováděná metodou sekvenace nové generace. Výsledky obou metod potvrdily hypotézu zonace aktivní reduktivní dechlorace v souladu s hydrogeochmickými parametry. Druhým cílem dizertační práce bylo vyvinout nanovlákenné nosiče, které by bylo možné opakovaně použít při dlouhodobém sledování kontaminované lokality, protože odběr vzorků podzemních vod, jejich transport a zpracování je komplikovaný. Podobně pravidelný odběr vzorků půdy není možný nejen z důvodu finančních, ale i sporné reprodukovatelnosti. Vyvinuté nanovlákenné nosiče jsou kompaktní, dostatečně malé, snadno přenositelné, a především vhodné pro izolaci DNA. Dlouhodobé testy in situ potvrdily funkčnost pro využití nanovlákenných nosičů pro molekulárně genetické analýzy autochtonní mikroflóry. Jednotlivé varianty nanovlákenných nosičů byly patentovány.

Keywords

bioremediace, kontaminované lokality, chlorované etheny, molekulární genetika, nosiče nanovláken

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 8. 2018

Thesis defence

Technical University of Liberec

Faculty of Mechatronics, Informatics and Interdisciplinary Studies

Doctoral programme / field:
Applied Science in Technology / Applied Science in Technology