Vliv doby a teploty skladování na kvalitu kryokonzervovaných spermií Danio rerio

Bc. Nikol Pavlů

Master's thesis

Effect of storage time and temperature on the quality of cryopreserved zebrafish sperm

Abstract:

Cílem této práce je ověření hypotézy, že délka a teplota skladování, ve které jsou umístěny kryokonzervované spermie Danio rerio, má vliv na úspěšnost in vitro fertilizace.Spermie Dánia pruhovaného byly odebrány z extrahovaných varlat. Tato varlata byla po vyjmutí rozdrcena v kryokonzervačním roztoku bez kryoprotektantu, aby se uvolnily spermie. Následně byl přidán k roztoku spermií roztok s kryoprotektantem (metanol) v poměru 5 l roztoku se spermiemi na 15 l roztoku s kryoprotektantem. Kryokonzervované dávky byly skladovány v kryovialkách. Nejdříve byly tyto kryovialky umístěny na suchý led a po 20 minutách vloženy do tekutého dusíku, ve kterém jedna polovina kryovialek byla dále uchovávána a druhá přesunuta po deseti minutách do -80 °C. V rámci pokusu byly testovány dvě teploty skladování (-196 °C, -80 °C) a tři doby skladování (1 den, 1 týden, 2 měsíce). Po uplynutí každého časového úseku bylo rozmraženo 12 kryovialek z -196 °C a 12 z -80 °C ve vodní lázni o teplotě 38 °C. Samičkám v narkóze se odebrala vajíčka pomocí masáže břicha, k vajíčkům byla přidána rozmražená dávka spermií spolu s vodou. Vajíčka byla inkubována v 28 °C po dobu 24 hodin. Po tomto čase bylo provedeno finální přepočítání životaschopných embryí. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí Studentova T-testu a ANOVY. Všechny testy byly hodnoceny na hladině významnosti p < 0,05. Z kryokonzervovaných spermií skladovaných v -196 °C bylo za 24 hodin vyvinuto průměrně 12,5 ± 2,2 % embryí. V hluboko mrazícím boxu -80 °C bylo průměrně vyvinutých embryí 24 hodin po oplození pouze 0,1± 0,1 %. Navíc embrya se vyvíjela jen ze spermií skladovaných pouze 1 den a bylo jich minimální množství (0,3 ± 0,3 %). Z tohoto pokusu vyplývá, že spermie Dánia pruhovaného nelze skladovat v -80 °C.Kryokonzervované dávky, skladované jeden den, dosahovaly 24 hodin po oplození úspěšnosti 13,4 ± 4,7 % životaschopných embryí, kryokonzervované dávky skladované jeden týden 10,7 ± 4,3 % vyvinutých embryí a kryokonzervované dávky skladované dva měsíce 13,4 ± 4,3 %. Pro kontrolu byly zaznamenány hodnoty z tření samic v laboratorních podmínkách, kdy embrya dosahovala 24 hodin po oplození přežitelnosti ve výši 81,4 ± 4,3 % a po IVF čerstvým spermatem se vyvinulo 35,0 ± 4,5 %. Mezi kryokonzervovanými dávkami spermií nebyl zaznamenán rozdíl v délce skladování.

Abstract:

The aim of this diploma thesis is verification of hyphothesis, that the lenght and temperature of storage, in which the cryopreserved sperm are placed, have an impact on success on in vitro fertilization. Zebrafish sperm were removed by testis dissection. These testes were crushed into cryopreserved liquid without cryprotectant to release the sperms. Then, the cryoprotectant (methanol) was added to sperm liquid at a ratio of 5 l sperm liquid and 15 l cryprotectant. The sperm solution were storaged in cryovials. The cryovials were placed on dry ice for 20 minutes and than put into liquid nitrogen. The one half of cryvials were placed in the liquid nitrogen for whole time and the second half after ten minutes were transfered to -80 °C ultra-freezer. Within this experiment two temperatures of storage (-196 °C, -80 °C) and three storage periods (one day, one week and two months) were tested. After each tested period were thawed 12 cryovials from both tested temperatures (-196 °C and -80 °C) transfered in water bath to 38 °C. Anesthetized females were squeezed the eggs using abdominal massage. The post thawed sperms with water were added to the eggs. The eggs were incubated at 28 °C for 24 hours. After dedicated time, the final recalculation of viabled embryos were done. The statistical evaluation was calculated using Student‘s T-test and ANOVA. All tests were evaluated at the significance level p <0.05.The storaged temperature of zebrafish cryopreserved sperm is very important. In average, 12.5 ± 2.2% embryos were evolved after 24 hours from cryopreserved sperm at the temperatures of -196 °C. In average, 0.1 ± 0.1% embryos were evolved after 24 hours from crypreserved sperm in the ultra-freezer at the temperatures of -80 °C. Moreover, the embryos developed only from sperms storaged for one day was minimal (0.3 ± 0.3%). This experiment follows that zebrafish sperms is impossible to storage at he -80 °C temperature.The crypreserved sperm storaged for one day reached the success rate at the level of 13.4 ± 4.7% viabled embryos after 24 hours after IVF, for one week reached the success rate at the level of 10.7 ± 4.3% viabled embryos and for two months the success rate at the level of 13.4 ± 4.3% viabled embryos. The values were written down from female‘s friction in lab condition for checkup. The embryos reached the success rate at a level of 81.4 ± 4.3% after 24 hours after IVF of fresh sperm evolved 35.0 ± 4.5% embryos. Between both types of cryopreserved sperm was not noticed any differences in the storaged lenght.

Keywords

spermie, kryokonzervace, Danio rerio, IVF, embryo

Keywords

cryopreservation, zebrafish, IVF, sperm, embryo

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jiří Šichtař, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology