Identifikace enzymových aktivit štěpících sacharosu v kultuře bakterie Leuconostoc garlicum.

Bc. Viktor Holomek

Diplomová práce

Identification of Sucrose-Processing Enzyme Activities in Culture of Bacterium Leuconostoc Garlicum

Anotace:

Dextransacharasa je enzym, původně izolovaný z bakterie Leuconostoc mesenteroides, který katalyzuje přenos zbytků D-glukopyranosylu ze sacharózy do struktury dextranu, přičemž se uvolňuje fruktosa. Dextran je látka hojně používaná v lékařství jako náhradní koloidní roztok krevní plasmy (plasmaexpander). Využívá se i jako sorbent k separaci molekul v náplňových kolonách (sephadex). Dextran tvořený bakterií leuconostoc garlicum vykazuje relativně vysoký stupeň čistoty a její roztoky vykazují relativně nízkou viskozitu. Existuje několik možných metod jak prokázat aktivitu enzymu s jeho následnou izolací. Některé tyto postupy jsou studovány v této práci. Enzymová aktivita štěpící sacharosu může být prokázána metodou na redukující cukry, která využívá kyseliny bicinchoninové. Metoda je založena na detekci měďných iontů vzniklých redukcí iontů měďnatých redukujícími sacharidy pomocí této kyseliny. S využitím této metody bylo možno stanovit Michaelisovu konstantu enzymu, Pro ověření identity enzymové reakce byla vyvinuta metoda na bázi chromatografie na tenké vrstvě. Ta slouží k rozlišení jednotlivých redukujících monosacharidů, a tedy k určení vedlejšího produktu enzymem katalyzované reakce. Zjištěná přítomnost fruktosy v reakční směsi potvrzuje, že aktivním enzymem je skutečně dextransacharasa. Zároveň byla zkoumána i možnost detekce enzymové aktivity metodou zymogramu, tedy identifikace dextranu vytvořeného aktivní dextransacharasou v gelu po gelové elektroforéze. Tato metoda však neposkytla očekávané výsledky, pravděpodobně proto, že dextransacharasa je z podstatné části vázána na dextran. Byly rovněž učiněny pokusy o izolaci a zakoncentrování dextransacharasy, bylo však dosaženo pouze dílčího úspěchu metodou frakčního vysolování proteinů síranem amonným.

Abstract:

Dextransucrase is an enzyme izolated from bacterium Leuconostoc garlicum, which catalyzes the transfer of D-glukopyranosyl from sucrase to dextran structure, while fructose is released. Dextran is widely used in medicine as a substitute blood plasma colloid (plasma expander). Dextran can be used as a sorbent for molecular separation in packet column (sephadex). There are several methods of activity detection and isolation. Some of these methods are studied in this thesis. Enzyme activity cleaving sucrose can be detected using assay for reducing sugars, which makes use of bicinchoninic acid. This assay is based on the bicinchoninic-acid detection of Cu+ ions obtained by the reduction of Cu2+ ions by reducing carbohydrates . This method allowed us to determine the Michaelis constant of the enzyme. To confirm the identity of the enzymatic reaction a method based on thin-layer chromatography was developed. This method is able to distinguish among different reducing monosaccharides and thus to determine the byproduct of the enzymatic reaction. The presence of fructose in the reaction mixture determined this way indicates that the active enzyme is really dextransucrase. A possibility of detection of the enzyme activity by the method of zymogram, i.e. identification of dextran produced by the active dextransucrase in a gel after gel electrophoresis, was studied simultaneously. However, this method did not bring expected results, likely due to the fact that a substantial part of dextransucrase is bound to dextran. Attempts were made in order to isolate and concentrate dextransucrase, but only one method, fraction precipitation by ammonium sulfate, was partially successful. Here you are, after incubation of the enzyme are sucrose, the fructose created spots visible, which are freely into solution. Since it is likely that dextransucrase is bound to the resulting dextran, it is possible to perform the method of zymogram. This method is based on the detection of dextranu. For the separation and concentration of the sample are suitable methods such as ammonium sulphate or fractionation gel chromatography. Chromatography in this case could not be used, due to the low concentration of the enzyme.

Klíčová slova

Dextran, dextransacharasa, enzym, Leuconostoc garlicum, aktivita, izolace

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 5. 2015

Zveřejnit od: 19. 5. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 6. 2015

Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně

Fakulta technologická

Magisterský studijní program / obor:
Chemie a technologie materiálů / Inženýrství ochrany životního prostředí