Příprava a testování biologické aktivity potenciálních nových inhibitorů polymerace tubulinu

Bc. Jana Želazková

Diplomová práce

Synthesis and evaluation of activity of new tubulin polymerization inhibitors

Anotace:

Dynamiky dělícího vřeténka představují významný cíl protinádorových léčiv. Řada malých přírodních a semisyntetických molekul má schopnost ovlivnit polymeraci tubulinu a vyvolat apoptózu u buněk s nadměrně častým dělením. Látky atakující kolchicinovou doménu tubulinu blokují jeho polymeraci. Přesto tyto látky dosud nejsou využity v léčbě nádorových onemocnění buďto díky nadměrné toxicitě nebo nedostatečné aktivitě anebo špatné rozpustnosti. V rámci mé diplomové práce navazující na práci bakalářskou byly shromážděny poznatky o strukturách vázajících se do kolchicinové domény, jejich účinnosti a toxicitě. Na základě vztahu mezi strukturou a aktivitou byly s cílem získat aktivní látky navrženy molekuly aryltetralinového a dibenzylbutyrolaktonového typu podobné lignanům. Ze struktur byly zároveň eliminovány typicky toxické skupiny. Dvě nové látky dibenzylbutyrolaktonového typu 75 a 76 byly získány totální syntézou ze substituovaného benzaldehydu a benzylbromidu a z dimethyl-sukcinátu. Připravený substituovaný benzaldehyd kondenzoval ve Stobbeho reakci s dimethyl-sukcinátem. Následující selektivní hydrogenace dvojné vazby a selektivní redukce esteru v přítomnosti karboxylu vedly k získání β-benzylbutyrolaktonu. Alkylace enolátu benzylbutyrolaktonu substituovaným benzylbromidem poskytla po odstranění chránící skupiny požadovaný dibenzylbutyrolakton 75. Sloučenina 76 byla získána v jednom kroku metylací látky 75. Vliv látek na polymeraci tubulinu byl sledován in vitro měřením turbidity tubulinu v přítomnosti a nepřítomnosti testovaných látek. Experimenty byly provedeny v 96 jamkovém formátu za teploty 37 °C. Polymerace tubulinu byla započata přidáním GTP. Podophyllotoxin vážící se do kolchicinové domény tubulinu byl použit jako pozitivní kontrola. Ukázalo se, že obě připravené sloučeniny jsou in vitro aktivní a inhibují polymeraci tubulinu. Pro látku 76 byla stanovena orientační IC50 2 μM bez předchozí preinkubace látky s tubulinem. Vliv látky na dynamiky tubulinu byl preinkubací pozměněn, což je ve shodě s mechanismem, kterým látky vázající se do kolchicinové domény působí na dynamiku tubulinu. Inhibitory se váží k volným heterodimerům tubulinu, které jsou následně inkorporovány do vznikajícího polymeru. Není-li tubulin s látkou před zahájením polymerace inkubován, o volné heterodimery soutěží inhibitor a polymerační reakce. V preinkubovaném systému byla látka 75 nejúčinnější v koncentraci 1 μM z testované logaritmické stupnice 0,1, 1, 10 a 100 μM. Látka 76 byla nejúčinnější při koncentracích 0,1 μM, což mohlo být způsobeno také pomalým vysrážením látky při vyšších koncentracích. Vzhledem k omezenému množství proteinu nemohly být provedeny další experimenty potřebné pro stanovení IC50 pro látky preinkubované s tubulinem. Měřené turbidity po preinkubaci byly nižší než hodnoty získané v experimentu bez preinkubace látky 75 s tubulinem, což naznačuje, že IC50 budou po preinkubaci nižší. Pro učinění definitivního závěru v tomto směru je počet provedených experimentů nedostatečný. Jestliže bude prokázána vazba látek do kolchicinové domény, je pravděpodobné, že účinkuje pouze R,R-enantiomer a použití opticky čisté látky může vést k dalšímu snížení IC50.

Abstract:

Mitotic spindle dynamics represent important target of anticancer drugs. Many small natural and semi-synthetic drugs influence tubulin assembly and cause apoptosis of excessively dividing cells. Molecules attacking the colchicine domain of tubulin block its polymerization. Despite this there are colchicine site inhibitors (CSis) not used in cancer treatment due to their high toxicity or low activity or poor solubility. This thesis is a follow-up to the bachelor thesis and comprises information about the activity and toxicity of structures interacting with the colchicine domain. On the basis of the structure-activity relationship there were designed aryltetralin and dibenzylbutyrolactone lignan-like molecules in an attempt to obtain active drugs. Structure modifications embraced the elimination of typically toxic groups. Two new dibenzylbutyrolactone-type compounds 75 and 76 were prepared in a total synthesis from the substituted benzaldehyde and benzyl bromide and from the dimethyl succinate. The Stobbe condensation of the substituted benzaldehyde with dimethyl succinate followed with the selective hydrogenation of the double bond and the selective reduction of ester in the presence of carboxyl led to the β-benzylbutyrolactone. Alkylation of butyrolactone enolate with a substituted benzyl bromide provided after phenolic group deprotection dibenzylbutyrolactone 75. Compound 76 was obtained in the one-step methylation of 75. The drugs´ effect on microtubule polymerization was evaluated in vitro. The turbidity of tubulin was measured in the presence or absence of test compounds in a 96-well plate at 37 °C. Assembly was initiated by the addition of GTP. CSi podophyllotoxin was employed as a positive control. Both compound 75 and 76 inhibited tubulin polymerization. Compound 75 inhibited assembly with the IC50 value roughly of 2 μM without drug-tubulin preincubation. Drug-tubulin preincubation enhanced the drug effect on polymerization, which is in good agreement with the mechanism of CSis action. CSis first bind to the soluble heterodimer of the tubulin, which then adds to the growing microtubule. When the preincubation is not employed, the drug must compete with the assembly reaction for free dimers. After drug-tubulin preincubation, the compound 75 was most effective at a 1 μM concentration of the tested logarithmic step scale 0.1, 1, 10 and 100 μM. Drug 76 was most effective at a 0.1 μM concentration. This could be caused by drug precipitation at higher concentrations. Owing to the limited amount of tubulin there could not be carried out further measurements indispensable for the determination of IC50 for drugs preincubated with protein. Turbidity measured after preincubation of drug 75 with the tubulin was lower than values in the experiment without preincubation. These data suggest that IC50 for the preincubated system will be lower. The amount of experiments is insufficient for a definite conclusion. If compounds 75 and 76 are established to be CSis, it will be supposed that only R,R-enantiomer is effective. Hence, use of optically pure compounds can lead to a further decrease of IC50.

Keywords

Tubulin, inhibitory polymerace tubulinu, kolchicinová doména, lignany Tubulin, tubulin polymerization inhibitors, colchicine binding site, lignans

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 1. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 2. 2011
• Vedoucí: Mgr. Jaromír Literák, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie