Mechanistická studie translézové syntézy DNA poškozené protinádorově účinnými komplexy kovů

Bc. Vojtěch NOVOHRADSKÝ

Master's thesis

Mechanistic study of translesion DNA synthesis across a damage by antitumor metal based complexes

Abstract:

Cisplatina si i po více než třiceti letech od uvedení na trh udržela své postavení mezi dostupnými chemoterapeutiky. Nelze však zanedbat skutečnost, že při terapii dochází k negativnímu ovlivnění kvality života pacienta a také případně ke vzniku rezistence vůči léčivu. Mechanismus účinku komplexu je multifaktoriální, hlavním faktorem zodpovědným za cytotoxické působení cisplatiny je její vazba na DNA a následné poškození struktury a funkce DNA. Majoritními typy tvořených aduktů jsou sekvenčně specifické AG a GG vnitrořetězcové (IAC) můstky, jejichž přítomnost v řetězci DNA způsobuje destabilizační změny dvouřetězcové struktury DNA. Změna struktury a stability duplexu DNA ovlivňuje mimo jiné činnost, DNA-dependentních DNA polymeráz, kdy DNA polymerázy účastnící se replikace nejsou schopny poškození překonat a tzv. translézově aktivní polymerázy překlenují léčivem vytvořenou překážku. V lidské buňce vykazuje vysokou procesivitu při překonávání cisplatinou vytvořených aduktů polymeráza éta, která vykazuje vysokou přesnost (fidelitu). Často využívaným modelem eukaryotických polymeráz při in vitro experimentech je prokaryotický Klenowův fragment DNA polymerázy I (E. coli). Experimenty prokazující vzájemné diference mezi prokaryotickým a eukaryotickým typem translézově aktivní DNA polymerázy byly zaměřeny zejména na studium kinetiky a vlivu koncentrace enzymu při překonávání sekvenčně specifických vnitrořetězcových aduktů. Z výsledků této diplomové práce vyplývá, že Klenowův fragment rozlišuje při translézové syntéze mezi vnitrořetězcovými můstky AG a GG. Výraznější schopnost inhibovat syntézu produktu plné délky (FLP) vykazuje AG IAC můstek a vzájemné rozdíly mezi adukty jsou pak nejpatrnější při použití primeru, který svým 3´ koncem nasedá až k lézi. Na rozdíl od bakteriální DNA polymerázy, lidská polymeráza ? mezi oběma typy můstků nerozlišuje. Termodynamická analýza určení bodu tání oligonukleotidu potvrdila větší schopnost destabilizace dvouřetězcové struktury AG IAC můstkem ve srovnání s můstkem GG.

Abstract:

Cisplatin even after more than thirty years since it was introduced in the clinic maintains its leading position among anticancer chemotherapetics. Due to great success of the treatment of testicular cancer, cisplatin continues to be almost exclusive medical drug suitable for treatment of this disease. However, it is impossible to neglect the fact that chemotherapy by cisplatin is accompanied by negative affection of the quality of life of patients and by acquired resistance. Mechanism underlying antitumor effects of cisplatin is multifactorial. The major factor responsible for cytotoxic effects of cisplatin is its binding to DNA and subsequent damage of its structure and function. Major types of the adducts formed on DNA by cisplatin are sequence-specific GG and AG intrastrand cross-links, the presence of which in the DNA strand destabilizes double-helical structure of this nucleic acids. Change of the structure and stability of DNA affects among others activity of DNA-dependent DNA polymerases, when DNA polymerases participating in DNA replication are unable to bypass DNA damage. On the other hand, so called translesion DNA polymerases can bypass the damage induced by the drug. In human cells, high fidelity DNA polymerase eta exhibits high processivity of bypassing adducts formed in DNA by cisplatin. Prokaryotic Klenow fragment of DNA polymerase I (E. coli) is a frequently used model of eukaryotic DNA polymerases exploited in in vitro experiments. Experiments demonstrating mutual differences between prokaryotic and eukaryotic types of translesion DNA polymerase were focused in particular on studies of kinetics and effects of the concentration of the enzyme on translesion DNA synthesis across sequence-specific intrastrand cross-links of cisplatin. The results of this diploma work show that Klenow fragment distinguishes, during DNA translesion synthesis, between GG and AG intrastrand cross-links. The AG intrastrand cross-link exhibits a more pronounced efficiency to inhibit synthesis of the full-length products. The mutual differences between the adducts are most apparent in the "standing start" experiments when the 3´ end of the primer is complementary to the base preceding the lesion. In contrast to prokaryotic DNA polymerase, human DNA polymerase eta does not distinguish between both types of the cross-link. Thermodynamic analysis, which was used to determine melting point of the oligonucleotide duplex confirmed greater capability of the destabilization of the double-stranded structure by the AG intrastrand cross-link in comparison with the GG intrastrand lesion.

Keywords

Cis-diammindichloroplatnatý komplex, cisplatina, translézové polymerázy, vnitrořetězcový můstek

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 4. 2011

Identifier: 120185

Thesis defence

• Supervisor: Prof. RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Physics / Biophysics