Porovnání mikroskopických a přístrojových výsledků jednotlivých typů krvinek se zaměřením na trombocyty

Michaela DRÁBOVÁ

Bachelor's thesis

Comparison of microscopic and instrumental results of individual blood cell types with a focus on platelets

Abstract:

Cílem mé práce je stanovení počtu krevních destiček více metodami. Dále určení příčiny zjištěných rozdílů v počtu trombocytů. A posledním cílem je určení algoritmu pro jejich spolehlivé počítání. Moje hypotéza je zaměřena na specifické situace, ve kterých může být přístrojové stanovení hladin trombocytů výrazně odlišné od skutečnosti. Pro získání jejich skutečného počtu je nutné užití alternativní metody. Za alternativní metodu je považováno mikroskopické stanovení nebo stanovení počtu trombocytů z citrátu sodného. Hypotéza I. Použitím alternativních metod dostaneme u části populace jiné výsledky. Hypotéza II. Tyto alternativní metody nám pomáhají pro rozlišení pravé a falešné trombocytopenie. Teoretická část bakalářské práce se zabývá tvorbou, strukturou, fyziologií, funkcí, metabolismem a charakteristikami krevní destičky. Je definován pojem trombocytopenie. Je zmíněna kontrola kvality laboratorních analýz. Jsou popisovány různé protisrážlivé přípravky používané v hematologii. Dále techniky, kterými se počet trombocytů dá stanovit a také interference spojené s měřením krevních buněk. Praktická část zahrnuje zpracování biologického materiálu ve vakuetě s fialovým uzávěrem, kde se nachází antikoagulant EDTA (pro rutinní stanovení celého krevního obrazu) a zároveň ve vakuetě s modrým uzávěrem, kde se nachází antikoagulant citrát sodný (pro opakované stanovení pouze počtu trombocytů). Analýza tohoto biologického materiálu byla provedena pomocí analyzátoru Coulter LH 750, společnosti Beckman Coulter. Metodou Coulter se zjistí velikost krevních buněk díky změnám elektrického odporu. Zpracování biologického materiálu manuálně bylo provedeno pomocí světelného mikroskopu společnosti Carl Zeiss, jehož celkové zvětšení, které stačí na pozorování trombocytů, je 400násobné. Počet trombocytů se hodnotí v Bürkerově komůrce, ve 20 obdélnících. Pro jejich stabilizaci a zvýraznění se používá roztoku prokainu. Na oddělení klinické hematologie, Nemocnice České Budějovice a.s., jsem v období 23. dubna - 22. května 2012 zjišťovala počet trombocytů ve dvou různých antikoagulanciích, s použitím rozdílných technik měření. Toto porovnání je důležité, protože pokud by byl rozdíl v počtu trombocytů zjištěných z antikoagulancia EDTA v porovnání s citrátem sodným vyšší než 20 %, mohlo by se jednat o vzorky s podezřením na pseudotrombocytopenii. Vlastní měření zahrnovalo padesát vzorků, které byly vybírány již s určitým podezřením podle následujících kritérií: počty trombocytů musely klesnout pod hranici 100 x 10^9/l a zároveň jsme museli obdržet hlášení analyzátoru o přítomnosti shluků. Naměřené hodnoty trombocytů byly statisticky zpracovány a jsou v mé bakalářské práci zobrazeny v příslušných tabulkách a grafech. Pro lepší představu jsou zde také obrázky a to především histogramy, vypovídající o určitých změnách v počtu a objemu krevních buněk. Tento výzkum prokázal výskyt jevu PTCP v 0,052 % případů. Rozdíl mezi užitými technikami byl jasně patrný, mikroskopie nedosáhne takových přesných výsledků jako analyzátor. Množství vzorků a rychlost jejich provedení se nedá porovnávat. Mikroskopie nám v dnešní době slouží spíše jako pomocná technika v těch případech, kdy je přístroj nedokonalostmi (např. tvorbou shluků) ovlivněn natolik, že vydává falešné počty trombocytů. Nevýhodou je však časová prodleva od odběru do možného počítání. Alternativními metodami dosáhneme případného ověření či upravení (např. opakovaný odběr do jiného antikoagulancia) prvotních výsledků.

Abstract:

The aim of my thesis is to determine the number of platelets with different methods; then to determine the cause of the measured differences in the number of platelets, followed by determination of algorithm for reliable counting of platelets. In specific situations, the instrument determination of the levels of platelets may be significantly different from the real situation. The actual number of platelets can be obtained by using alternative methods. Microscopic assessment and determination of the number of platelets in sodium citrate are considered as alternative methods. Hypothesis I. When using alternative methods, different results are obtained in part of the population. Hypothesis II. These alternative methods help us to distinguish between true and false thrombocytopenia. The theoretical part deals with the formation, structure, physiology, function, metabolism and characteristics of platelets. The term of thrombocytopenia is defined. Quality control of laboratory analyzes is mentioned. Different anticoagulant products used in hematology are described. There are also described techniques by which platelets can be determined and interference associated with the measurement of blood cells. The practical part includes the processing of biological material in a test-tube with the purple cap containing anticoagulant EDTA (from this test-tube a complete blood count is provided), while a test-tube with the blue cap contains anticoagulant sodium citrate (this test-tube is only for re-determination of the platelets count). Analysis of biological material was performed by the analyzer Coulter LH 750, Beckman Coulter Inc. The Coulter method measures the size of blood cells due to changes in electrical resistance. Manual processing of biological material was performed using a light microscope Carl Zeiss Inc., the total magnification for observation of platelets is 400 times. Number of platelets is evaluated in Bürker chamber in 20 rectangles. Solution of procaine is used to stabilize and highlight the platelets. In the period of 23rd April - 22nd May 2012 at the department of Clinical Hematology, Nemocnice České Budějovice a.s., I examined the platelets count in two different anticoagulants by using different measurement techniques. This comparison is important because if the difference in the number of platelets found in EDTA anticoagulant compared with sodium citrate is higher than 20 %, the samples could be suspected of pseudothrombocytopenia. The measurement included fifty samples which were selected already with some suspicion according to following two criteria: the platelets count had to fall below 100 x 10^9/l and at the same time we had received analyzer report of the presence of clumps. The measured values of platelets were statistically processed and they are shown in charts and graphs in my thesis. For a better idea there are also pictures - especially histograms showing some changes in the number and volume of blood cells. This research has demonstrated the occurrence of the phenomenon PTCP in 0,052% cases. The difference between the techniques was clearly evident. Microscopy does not reach such accurate results as analyzers. Quantity of samples and speed of implementation can not be compared. Nowadays microscopy is used as an auxiliary technique in those cases where the analyzer is too affected by imperfections (for example formation of clumps) that it gives false platelets count. The disadvantage is the time delay from the sampling to the possibility of counting. By alternative methods we reach eventual verification or modification of first results (for example repeated sampling to another anticoagulant).

Keywords

Bürkerova komůrka, Citrát sodný, Elektrická impedance, Kyselina ethylendiamintetraoctová, Pseudotrombocytopenie, Trombocyty

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2013

Accessible from:: 3. 5. 2013

Thesis defence

• Supervisor: MUDr. Ivan Vonke, MBA

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Technician