Elektochemická analýza poškození DNA

Mgr. Kateřina Cahová, Ph.D.

Disertační práce

Electrochemical analysis of DNA damage

Anotace:

Studium nukleových kyselin je v popředí zájmu vědců již od poloviny minulého století, kdy Watson s Crickem objevili strukturu dvoušroubovice DNA. V současné době se jedná především o vývoj spolehlivých DNA biosenzorů a čipů, které umožňují detekovat hybridizaci DNA, případně její interakci s různými látkami. Tématem této práce je elektrochemická analýza poškození DNA. Poškození DNA v buňkách ovlivňuje schopnost její replikace a exprese genetické informace, a interakce DNA s chemickými nebo fyzikálními činiteli tedy muže vést ve svém důsledku ke vzniku vážných onemocnění, zahrnujících také rakovinu. Elektrochemické metody našly uplatnění v analýze nukleových kyselin v šedesátých letech minulého století, kdy byly publikovány první práce, zabývající se elektroaktivitou a povrchovou aktivitou DNA. Nukleové kyseliny mohou být analyzovány pomocí různých elektrochemických metod, neboť podléhají redukčním a tenzametrickým procesům na rtuťových elektrodách a oxidačním reakcím na elektrodách uhlíkových. Prostřednictvím elektrochemie lze také rozlišit strukturní změny v molekule DNA, čehož se dá využít při detekci takového poškození DNA, které souvisí s vytvořením jednořetězcových (ss) nebo dvouřetězcových (ds) zlomů. Poškození DNA jsme sledovali pomocí elektrody rtuťové (HMDE) a elektrod amalgámových (SAE), přičemž jsme využili několik různých přístupů. Jednak jsme detekovali poškození DNA v roztoku (reakce s DNázou I), dále pak elektroda modifikovaná nadšroubovicovou DNA sloužila jako senzor pro detekci látky poškozující DNA [redoxaktivní komplex Cu(phen)2)]. K detekci poškození bází jsme využili nový přístup, kombinující rozpoznání poškozeného místa (UV zářením, metylací) reparačním enzymem a detekci vzniklých ss zlomu nebo úseku voltametrickým měřením. Dále jsme aplikovali dvoupovrchovou techniku využívající magnetický nosič k detekci poškození dlouhé lineární plazmidové DNA.

Abstract:

Nucleic acids have been intensively studied by many scientists for about fifty years (since publication of the DNA double helix by Watson and Crick). At present, development of reliable DNA biosensors and chips belong to the main objectives. These biosensors should enable the detection of DNA hybridization or interaction of DNA with various agents. The topic of this thesis is electrochemical analysis of DNA damage. Damage to DNA in cells may alter the ability of DNA replication and gene expresion and the interactions of DNA with chemical or physical agents can subsequently lead to serious health disorders including cancer. Study of nucleic acids by electrochemical methods came in useful at sixties of last century when the first papers on electroactivity and surface activity of DNA were published. Nucleic acids can be analyzed using various electrochemical methods because of their reduction and tensammetric processes at the mercury electrode and oxidation reactions at the carbon electrodes. Electrochemistry can be also used for the detection of DNA structural changes including DNA damage related to formation of single- or doublestrand breaks. We analyzed the DNA damage using mercury and amalgam electrodes and we utilized several different approaches. We detected damage to DNA in solution (DNase I cleavage), electrode modified with supercoiled DNA served as a sensor for detection of a DNA cleaving agent [redox-active complex Cu(phen)2)]. For detection of damage to DNA bases we used a new approach combining recognition of damaged sites by DNA repair enzymes and voltammetric detection of resulting ss breaks or regions. We further proposed a double-surface method which we applied to detection of damage to long linear plasmid DNA.

Klíčová slova

poškození DNA, elektrochemická detekce, rtuťová elektroda, pevné amalgámové elektrody, reparační enzymy, dvoupovrchová technika DNA damage, electrochemical detection, mercury electrode, solid amalgam electrodes, repair enzymes, doublesurface technique

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 8. 3. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 3. 2006
• Vedoucí: prof. RNDr. Emil Paleček, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Fyzika / Biofyzika