Manipulace zárodečných buněk jako nástroj pro management a produkci izogenních linií u ryb

Roman FRANĚK

Disertační práce

Germ stem cell manipulations as a tool to manage and produce isogenic lines in fish

Abstract:

Isogenic lines in fish represent a fundamental approach to control the genetic background of experimental animals. All individuals from a given isogenic line share the same genotype. So far, isogenic fish lines have been produced only by repeated uniparental inheritance - androgenesis and gynogenesis. Homozygous progeny is produced in the first generation of uniparental inheritance, and each homozygous individual produces a different isogenic line after second generation of uniparental inheritance. Despite optimized procedures for inducing uniparental inheritance, isogenic lines have been successfully produced in only a few species of fish. Doubled haploids after first uniparental inheritance have affected fitness as well as reproductive performance. Long-term maintenance is considerably problematic even when isogenic line is established already, due to low viability and poor reproductive characteristics. The situation is further complicated by the fact that isogenic lines are usually naturally monosex, thus uniparental inheritance must be re-used for further reproduction, or sex reversal needs to be applied in part of isogenic line. Several types of germ cell manipulation were performed in presented thesis. Protocols for cryopreservation of spermatogonia and oogonia have been developed and optimized to maximize post-thaw viability. The physiological activity of cryopreserved cells was confirmed by transplantation into a surrogate host. Cryopreserved and subsequently transplanted cells retained colonization activity comparable to non-frozen control germ cells. More importantly, male germ cells were able to transdifferentiate from oogonia. The success of transplantation was confirmed by detection of expression of genes associated with gametogenesis in carp by RT-PCR. In the next study, the results of cryopreservation experiments were followed, where sterile goldfish was identified as a suitable host for homozygous carp cells. Germ cells obtained from several homozygous individuals were individually transplanted into sterile goldfish. This procedure has a potential to increase the chance of producing a viable gamete for isogenic line production. Germ cells from homozygotes with affected gametogenesis can be transferred to fully viable recipients, thereby increasing the efficiency of isogenic line production overall. In addition, the use of a goldfish as a surrogate parent will ensure that part of the germline chimeras will be male and female, thus isogenic gametes of both sexes can be obtained and no further intervention for further reproduction of the isogenic line. The suitability of triploid zebrafish, which can potentially be used as recipients for cells from homozygotes to produce isogenic lines, has been confirmed for zebrafish. Spermatogonia and oogonia from diploid donors were transplanted into artificially induced triploid larvae. Donor-derived sperm was were obtained upon maturation of triploid recipients. Transplanted oogonia transdifferentiated into spermatogonia and spermatozoa with female sex chromosomes have been produced, which may be of interesting for further studies of sex determination in zebrafish. A new germline transfer technique has been developed using striped embryos. Donor cells were transplanted from the blastula stage to the swim-up larvae. With this approach, undifferentiated primordial germ cells were able to colonize the genital groove and initiate gametogenesis. After reaching sexual maturity, germline chimeras were obtained with gametes and viable progeny. Although the overall efficacy of this method was lower compared to other transplantation methods, this study may be of relevance for germline rescue in poorly viable embryos or lethal mutants.

Abstract:

Izogenní linie ryb představují základní možnost kontroly genetického pozadí pokusných organismů, jelikož všichni jedinci z dané izogenní linie sdílejí stejný genotyp. Izogenní linie ryb byly dosud produkovány pouze opakovanou uniparentální dědičností - androgenezí a gynogenezí. V první generaci je produkováno homozygotní potomstvo, následně každý homozygotní jedinec po opětovné indukci uniparentální dědičnosti produkuje odlišnou izogenní linii. Navzdory optimalizovaným postupům pro indukci uniparentální dědičnosti byly izogenní linie úspěšně produkovány pouze u několika druhů ryb. Jejich dlouhodobé udržování je značně problematické z důvodu nízké životaschopnosti a nepříznivých reprodukčních charakteristik. Situace je dále komplikována tím, že izogenní linie jsou zpravidla přirozeně monosexní, kdy pro další reprodukci je nutné znovu použít uniparentální dědičnosti, nebo provést zvrat pohlaví u části jedinců. V této dizertační práci bylo provedeno několik typů manipulací se zárodečnými buňkami. Byly vyvinuty a optimalizovány protokoly pro kryokonzervaci spermatogonií a oogonií za účelem maximalizace jejich životaschopnosti po rozmrazení. Fyziologická aktivita kryoprezervovaných buněk byla potvrzena transplantací do náhradního hostitele. Kryoprezervované a následně transplantované buňky si v porovnání s nezamraženou kontrolou zachovaly srovnatelnou kolonizační aktivitu, byly schopny se transdiferenciovat ze spermatogonií na oogonie. Úspěch transplantace byl následně potvrzen detekcí exprese genů spojených s gametogenezí u kapra pomocí RT-PCR. V další studii byly zárodečné buňky z homozygotních donorů kapra obecného transplantovány do náhradních rodičů - karas obecný zlatá forma, kteří byli sterilizováni pomocí tlumení exprese genu zodpovědného za vývoj a migraci zárodečných buněk. Tento postup má potenciál zvýšit šanci na produkci životaschopný gamet. Zárodečné buňky homozygotů s různým stupněm poškození gameteogeneze mohou být přeneseny do plně životaschopných hostů a tím celkově zvýšit efektivitu produkce izogenních linií. Použití karase zlatého jakožto náhradního rodiče navíc zajistí, že část chimér zárodečné linie budu samci a část samice, tím pádem budou produkovány gamety obou pohlaví a pro další reprodukci izogenní linie nebude nutné dalších zásahů, které jsou běžně nutné pro udržitelnost izogenní linie. Vhodnost triploidních recipientů pro transplantaci zárodečných buněk, kteří mohou být potenciálně použity jako recipienti pro buňky z homozygotů za účelem produkce izogenních linií, byla potvrzena u kaprovitých ryb na modelu dánia pruhovaného. Spermatogonie a oogonie z diploidních donorů byly transplantovány do uměle indukovaných triploidních larev. Po dosažení pohlavní dospělosti byly získány spermie původem z transplantovaných buněk donora. Oogonie se transdiferenciovaly do spermatogonií a byly produkovány spermie s pohlavními chromozomy samic, které mohou být zajímavé pro další studie determinace pohlaví u dánia pruhovaného. Dále byla vyvinuta nová technika pro přenos zárodečné linie linií byla vyvinuta s použitím embryí dánia pruhovaného. Buňky dárce byly transplantovány ze stádia blastuly do rozplavaných larev. S tímto přístupem byly nediferencované primordiální zárodečné buňky schopny kolonizovat genitální rýhu a zahájit gametogenezi. Po dosažení pohlavní dospělosti chimér zárodečné linie byly získány gamety a životaschopné potomstvo. Ačkoli celková účinnost této metody byla ve srovnání s jinými transplantačními metodami nižší, tato studie může mít význam pro záchranu zárodečné linie u málo životaschopných embryí nebo letálních mutantů.

Keywords

Izogenní linie, Kapr obecný, Dánio pruhované, Zárodečné buňky, Náhradní reprodukce, Kryoprezervace

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 9. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Martin Pšenička, Ph.D.

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Fakulta rybářství a ochrany vod

Doktorský studijní program / obor:
Zootechnika / Rybářství