Optimalizace detekce NADPH oxidázové aktivity v epiteliálních buňkách

Bc. Hana Kolářová, Ph.D.

Master's thesis

Optimalisation of NADPH activity-detection in epithelial cells

Abstract:

Řada studií za poslední desetiletí dokumentovaly expresi NADPH oxidáz v buňkách, které nejsou profesionálními fagocyty. Tyto proteiny jsou strukturálně podobné fagocytárním NADPH oxidázám a v odpovědi na cytokiny, vápníkové signály a růstové faktory produkují nízkou hladinu reaktivních kyslíkatých metabolitů (RMK). Buňky pak tyto RMK využívají k fyziologickým funkcím jako jsou signální transdukce nebo biochemické reakce. Kromě toho bylo prokázané, že mohou být zahrnuty i v celé řadě patologických stavů. Z experimentálního a potenciálně klinického hlediska je tedy důležité detekovat tvorbu RMK. Cílem této práce je optimalizovat metody využitelné pro stanovení NADPH oxidázové aktivity u epiteliálních buněk. Produkce RMK byla stanovena prostřednictvím vybraných fluorescenčních metod s využitím fluorescenčních značek amplex red, dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) a hydroethidium (HE), dále spektrofotometrických metod založených na redukci nitrotetrazolium blue chlorid (NBT) a cytochromu c. Poslední z testovaných metod byla chemiluminiscence využívající luminol a analog luminolu L-012 jako chemiluminiscenční značky. Na základě výsledků lze říct, že byla prokázána možnost detekce produkce RMK použitím fluorescenčních značek DCFH-DA a HE, spektrofotometrickou metodou založenou na redukci NBT a L-012 zesílenou chemiluminiscencí.

Abstract:

Studies over the last decade have documented expression of NADPH oxidase in cells which are not professional phagocytes. These enzymes are structurally related to the phagocytic NADPH oxidases and produce low levels of reactive oxygen species (ROS) in response to cytokines, calcium signals and growth factors. Cells use these ROS for physiological functions such as signal transduction or biochemical reactions. There was evidence that these ROS were also involved in pathological conditions. Out of research and potentially clinical aspect it is important to detect ROS. The aim of the study was the optimalization of methods available for detection of NADPH oxidase activity in epithelial cells. The production of ROS was determined by fluorometric method using 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate and hydroethidine probes, spectrophotometric methods based on nitrotetrazolium blue chloride reduction and cytochrome c reduction and chemiluminescence-based assays using luminol and luminol analogue L-012 probes. Production of ROS was observed by fluorometric (using DCFH-DA and HE probes), spectrofotometric (NBT test) and by L-012-enhanced chemiluminescence.

Keywords

nefagocytární NADPH oxidáza, reaktivní kyslíkaté metabolity (RMK), fluorescenční metody, DCFH-DA, HE, Amplex Red, spektrofotometrické metody, redukce cytochromu c, NBT-test, chemiluminiscence

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 12. 6. 2008
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / General Biology