Vliv forskolinových derivátů na aktivitu vybraných izoforem adenyl cykláz

Bc. Petra Daďová

Master's thesis

Effects of forskolin derivatives on the activity of selected isoforms of adenyl cyclases

Abstract:

Cyklický adenosin 3´, 5´- monofosfát (cAMP) hraje významnou roli jako sekundární posel v buněčné signalizaci. Jeho syntézu katalyzuje enzym adenyl cykláza (AC). Dosud bylo identifikováno deset izoforem AC, které jsou distribuovány v různých tkáních v různé míře. Výzkum specifických látek selektivně aktivujících či inhibujících různé izoformy AC naznačuje, že se AC mohou potenciálně stát významným cílem léčiv. Hlavním neselektivním aktivátorem AC je forskolin, který se váže přímo na katalytickou podjednotku většiny AC. Cílem této práce bylo vytvořit stabilně transfekovanou buněčnou linii HEK293 s vysokou mírou exprese osmi izoforem AC. Tato exprese byla testována na úrovni mRNA reverzní transkripcí spojenou s kvantitativní PCR v reálném čase (RT-qPCR). Na vybraných klonech byla detekována enzymová aktivita jednotlivých izoforem AC metodou homogenní kompetitivní imunoanalýzy využívající k detekci Försterův rezonanční přenos energie s časovým rozlišením (TR-FRET). Změny v aktivitě AC byly testovány v přítomnosti forskolinu a jeho derivátů. Celkově lze shrnout, že byly vytvořeny klony se specificky zvýšenou expresí vybrané izoformy AC a tyto buněčné klony je možné využít pro testování modulátorů aktivity AC.

Abstract:

Cyclic adenosine 3´, 5´- monophosphate (cAMP) plays an important role as a secondary messenger in cell signaling. cAMP synthesis is catalyzed by enzyme adenyl cyclase (AC). There have been identified ten AC isoforms that are distributed in different tissues at varying extent. The research of specific isoform-selective AC inhibitors and activators suggests that ACs could potentially be an important drug targets. The main non-selective AC activator forskolin directly binds to the catalytic subunit of the most AC isoforms. The aim of this study was to create a stably transfected HEK293 cell line with high level of expression of eight selected AC isoforms. This overexpression was tested at the mRNA level by reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). The AC enzymatic activity was determined in selected clones overexpressing particular AC isoforms by homogeneous competitive immunoassay using for detection a method called Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer (TR-FRET). The AC activity was tested in the presence of forskolin and its derivatives. Overall, it was demonstrated that the clones with specifically overexpression of selected AC isoforms were created. This cell clones can be used for testing of modulators of AC activity.

Keywords

adenyl cykláza, cAMP, forskolin, colforsin, HEK293, adenylate cyclase

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 2. 6. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry