Hledání optimálních podmínek izolačního postupu pro přípravu templátového materiálu za účelem studia genové exprese mesenchymálních stromálních buněk pupečníkové tkáně

RNDr. Zora NOVÁKOVÁ, Ph.D.

Bachelor's thesis

Optimization of izolation technique utilized for preparation of template material suitable for gene expression analysis of mesenchymal stromal cells from umbilical cord tissue

Abstract:

Ribonukleová kyselina (RNA) je jednou z hlavních komponent systému regulace genové exprese, která probíhá v buňce jako odpověď na exogenní i endogenní stimuly. S rozvíjejícími se technikami molekulární biologie se stává tato molekula jedním z nejdůležitějších nástrojů pro analýzu genové exprese ve výzkumných, diagnostických i terapeutických postupech. Na rozdíl od deoxyribonukleové kyseliny má RNA velmi nestabilní charakter a proto je její izolace technicky náročnější. Pro účely studia genové exprese musí splňovat purifikovaná RNA několik parametrů, mezi nimiž je nejdůležitější čistota. Použité izolační postupy tedy musí zajistit efektivní separaci RNA od ostatních buněčných komponent i izolačních chemikálií. V současnosti se nabízí několik technik pro izolaci RNA, z nichž nejběžněji používané jsou dva typy izolace RNA kombinací guanidin thiokyanát-fenol-chloroform známá pod komerčním názvem TRIzol nebo TRI Reagent a extrakce RNA na pevné fázi neboli kolonová izolace. Tato studie shrnuje základní poznatky o povaze RNA jakožto biologické makromolekuly a popisuje postupy užívané pro její extrakci z biologického materiálu. Spektrofotometrie patří k nejčastěji užívaným metodikám v medicínských a biologických laboratořích. Proto je při výběru měřících zařízení kladen důraz na rychlost, přesnost, spolehlivost a jednoduchost ovládání přístroje. Vývoj spektrofotometrických zařízení pokračuje směrem k zpřesnění měření a snížení nároků na množství měřeného vzorku. Usnadňuje tak provedení rozsáhlých studií a zpřesňuje jejich výsledek. Při používání spektrofotometrů je vhodné seznámit se s fyzikálními principy a konstrukčními dispozicemi používaných spektrofotometrů. Tyto znalosti nám mohou pomoci ke správnému použití přístroje a interpretaci získaných dat. Tato práce shrnuje fyzikální zákony a základní principy týkající se elektromagnetického záření a spektrofotometrie, studie dále nastiňuje obecné schéma konstrukce spektrofotometrů a kritické parametry pro měření koncentrace nukleových kyselin. Cílem této studie bylo nalezení optimálních metodických postupů, které by poskytly dostatečné množství kvalitní RNA pro následnou analýzu genové exprese několika desítek molekulárních markerů ve větším počtu buněčných vzorků mesenchymálních stromálních buněk. Ve studii byly porovnány běžně užívané postupy izolace RNA určené pro následnou reversní transkripci. Testované metodiky zahrnovaly izolaci RNA kombinací guanidin thiokyanát-fenol-chloroform a extrakci na pevné fázi, celkem bylo porovnáváno sedm komerčních produktů. Hodnoceným parametrem byl výtěžek a čistota izolované RNA ve vztahu k množství zdrojového biologického materiálu. Studie zahrnovala srovnání kvality měření dvou spektrofotometrických přístrojů NanoDrop ND-1000 a BioPhotometer Eppendorf v parametrech přesnosti měření koncentrace a čistoty RNA, rychlosti měření, minimálního objemu vzorku nezbytného pro měření a výpovědní hodnoty výstupních dat přístroje. Srovnávací experimenty byly provedeny na sadě buněčných vzorků obsahujících různý počet mesenchymálních stromálních buněk a na komerčně získané purifikované RNA. Výsledky studie ukázaly, že v případě vzorků s malým množstvím zdrojového materiálu poskytuje technika extrakce RNA na pevné fázi kvalitnější RNA než izolace roztokem TRI Reagent. Z porovnávaných izolačních postupů vykazovala nejvyšší výtěžky i čistotu RNA souprava ZR RNA MicroPrep. Při porovnání spektrofotometrických přístrojů vykazoval přístroj NanoDrop lepší hodnoty všech posuzovaných parametrů; menší chybu a kratší dobu měření, spotřebu menšího množství vzorku pro měření a získání dat

Abstract:

s větší výpovědní hodnotou. V souhrnu byl pro plánovanou analýzu genové exprese zvolen izolační postup soupravou ZR RNA MicroPrep doplněný kvantifikací RNA pomocí spektrofotometru NanoDrop.

Abstract:

Ribonucleic acid (RNA) is the main component of the regulation of gene expression in the cell. As the development of techniques of molecular biology proceeds, RNA becomes an important tool for the gene expression analysis in research as well as diagnostic approaches. In contrast to deoxyribonucleic acid, RNA is very unstable and its isolation is tricky. RNA used for the gene expression analysis should fulfill several re foquirements focused especially on its purity. The isolation techniques should ensure effective separation of RNA from other cell components and chemicals used in the process. Currently, several methodologies are employed for the RNA isolation. The most common isolation is guanidine thiocyanate-phenol-chloroform combination called TRIzol or TRI Reagent and the extraction on solid phase so-called the column extraction. This study shows basic knowledge about macromolecule RNA and describes methodologies of RNA extraction from biological material. Spectrophotometry is very common technique used in laboratories. Thus the spectrophotometer is considered according to its speed, accuracy and simplicity of utilization. New improved devices reveal higher accuracy and lower requirements for the sample volume and make huge analyses much easier and more accurate. Getting knowledge about the principle and construction of the device we can improve utilization of the device and interpret the data correctly. In this study basic physical laws and principles concerning electromagnetic radiation and spectrophotometry are described, moreover, the basic model of spectrophotometer and critical parameters for nucleic acid quantification are shown. The aim of the study was to find the methodic approach for the isolation of unlimited amount of RNA of high quality suitable for high-throughput gene expression analysis of mesenchymal stromal cells. In the study several isolation techniques were compared to gain RNA suitable for reverse transcription reaction. These include isolation with guanidine thiocyanate-phenol-chloroform combination and column extraction. In total, yield and purity of RNA isolated by seven kits was compared in relation to the amount of cells used. The study involved comparison of two spectrophotometric devices NanoDrop ND-1000 and BioPhotometer Eppendorf. The accuracy of measurement of the concentration and the purity of RNA, speed, sample volume requirement and the weight of data acquired was compared between tested devices. A set of cell samples containing various number of mesenchymal stromal cells and commercially available RNA were used for testing purposes. The results of the study showed that in case of small cell number samples RNA isolated by column extraction is of higher quality than that isolated by TRI Reagent. From column-based kits the ZR RNA MicroPrep gave the best results the highest yield and purity of isolated RNA. From the spectrophotometric devices tested NanoDrop revealed smaller deviation of measurement, shorter time required for measurement, smaller sample volume requirement and higher weight of acquired data. In summary, ZR RNA MicroPrep and NanoDrop spectrophotometer were selected for preparation of RNA samples suitable for gene expression analysis.

Keywords

izolace ribonukleové kyseliny, extrakce na pevné fázi, TRI Reagent Solution, spektrofotometrické měření koncentrace, analýza genové exprese

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 5. 2014

Accessible from:: 5. 5. 2014

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Tibor Moško, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Zdravotní laborant