Úloha osmotických a iontových činidel ve fyziologii rybích spermií

MSc. Olga BONDARENKO

Doctoral thesis

The role of osmotic and ionic agents in fish sperm physiology

Abstract:

Tato studie byla zaměřena na objasnění role osmotických a iontových složek prostředí pro iniciaci motility spermií u různých sladkovodních druhů ryb. Navíc, byla zjišťována i úloha iontových a osmotických činidel i při dozrávání spermatu u jeseterů. První cíl práce byl zaměřen na studium osmotické regulace změn objemu spermií u různých druhů ryb. To vedlo ke zjištění, že schopnost spermatu zvětšovat svůj objem je druhově specifická: sperma druhů s iontovým módem aktivace motility (jeseter, pstruh) nemá žádnou detekovatelnou schopnost pro zvětšování objemu, zatímco objem spermií kapra (osmotický mód aktivace) koreluje s osmolalitou prostředí. Druhým cílem práce byla aplikace schopnosti změn objemu spermatu u kapra při proceduře kryoprezervace pro zlepšení kvality spermatu po následném rozmrazení. Po rozmrazení pak byly vyhodnocovány parametry motility a schopnost oplození jiker a tyto hodnoty byly porovnávány s kontrolou. U spermatu vystavenému hypotonickému mediu byla pozorována vyšší míra motility, velocity a oplozenosti ve srovnání se spermatem bez zásahu. Naše výsledky tak ukazují, že schopnost spermií pro hypotonické změny by mohla být využívána pro zlepšení procedury kryoprezervace spermatu. Třetím cílem naší práce bylo stanovení role environmentální osmolality a iontové kompozice v motilitě rybích spermií. Spermie jeseterovitých a lososovitých ryb byly aktivovány v médiích o různém iontovém a osmotickém složení. I přesto, že koncentrace Ca2+ v prostředí není zásadní v podmínkách za přítomnosti Na+, minimální intracelulární koncentrace volného Ca2+ by měla být přítomna ve spermatu u jeseterů pro iniciaci motility. Zdá se proto, že změny v osmolalitě nehrají hlavní roli v regulaci aktivace spermatu u pstruha. Změna podle sezónních výkyvů v citlivosti k Ca2+ byla zjištěna během tření. Nízká míra motility byla zjištěna u spermatu sivena na konci třecí sezóny. Nicméně, zvýšení koncentrace Ca2+ až na 10mM v aktivačním médiu vedlo k aktivaci motility nejméně u 85% spermatu, což naznačuje pokles citlivosti k Ca2+ u spermií na konci třecí sezóny. Čtvrtým cílem práce byla studie role osmotických a iontových činidel v dozrávání spermatu u jesetera malého. Naše výsledky demonstrují, že testikulární sperma jesetera postrádá schopnost aktivace motility a fertilizace. Během výtěru je sperma uvolněno z testes, prochází ledvinami, kde je rozptýleno s močí, až do Wolffova vývodu. Naše výsledky prvně ukazují, že inkubace testikulárního spermatu s močí kontroluje in vivo dozrávání, ale může být také provedena in vitro. Zjistili jsme, že dozrávání spermií nenastává za podmínek nedostatku Ca2+, což naznačuje že Ca2+ hraje zásadní roli v tomto procesu. Během procesu dozrávání jsme pozorovali postupný pokles senzitivity spermatu k environmentálnímu Ca2+. Zjistili jsme, že motilita testikulárního spermatu by mohla být aktivována jen v případě, že poskytovaná koncentrace Ca2+ je vysoká. Proto si myslíme, že proces dozrávání může být kontrolován přísunem Ca2+ do buněk s následným ukládáním zásob Ca2+. Pokud je nám známo, naše studie jako první poskytuje důkazy pro přítomnost zásob Ca2+ ve spermatu jesetera. Závěrem, výsledky této studie objasňují osmotickou a iontovou regulaci motility spermií u různých druhů ryb. Prokázali jsme zapojení specifických iontů spolu s osmotickým šokem při dozrávání a stárnutí rybího spermatu. Tyto poznatky rozšiřují možnosti in vitro manipulace spermií v rybářské praxi jako je například použití testikulárního spermatu, zlepšení nízké kvality spermií u lososovitých ryb na konci třecí sezóny a zvýšení odolnosti spermatu kapra při kryoprezervaci.

Abstract:

The present study focused on clarification of the roles of environmental osmolality and ion composition in the initiation of spermatozoa motility in different freshwater fish species. Additionally, the role of osmotic and ionic agents in sturgeon spermatozoa maturation was investigated. A first aim of the present study focused on studies of osmotic regulation of spermatozoa volume alterations in different fish species. This led to the discovery that spermatozoa swelling are species-specific: fish sperm with ionic mode of motility activation (sturgeon, trout) has no capacity for swelling, In contrast to carp sperm (osmotic mode of activation) for which volume correlates with environmental osmolality. A second aim was to apply the capacity for swelling in carp spermatozoa to improve the cryopreservation procedure relative to post-thaw sperm quality. Post-thaw motility parameters and ability to fertilize eggs were measured and compared with non-treated sperm. As a result, higher post-thaw motility rate, spermatozoa velocity, and fertilization rate were observed in sperm pretreated with hypotonic solutions compared to non-treated sperm. Thus, our results demonstrate for the first time, that spermatozoa ability for hypotonic changes could be used for improvement of cryopreservation procedure. A third aim of this study was the investigation of the role of environmental osmolality and ion composition in fish sperm motility. Sturgeons and salmonids sperm was activated in media of differing ionic and osmotic composition. Even though environmental Ca2+ concentration is not crucial in conditions of Na+ presence, a minimal intracellular free Ca2+ concentration should be present in sturgeon spermatozoa for initiation of motility. Alteration of osmolality does not seem to play a major regulatory role in trout spermatozoa activation. Alteration of sperm sensitivity to Ca2+ was detected during spawning, according to seasonality. Low motility rate was detected in brook trout spermatozoa at the end of the spawning period. However, a Ca2+ concentration increase up to 10 mM in activating media led to activate motility in at least 85% of the spermatozoa, which suggests a decrease of sperm sensitivity to Ca2+ at the end of the spawning season. The fourth aim was the study of the role of osmotic and ionic agents in sterlet spermatozoa maturation. Our results demonstrate that sturgeon testicular spermatozoa lack capability for motility activation and fertilization. During spawning, sperm is released from testis, pass through the kidney where it is mixed with urine, into the Wolffian duct. We demonstrated for the first time, that testicular sperm incubation with urine controls in vivo maturation, but can be performed in vitro as well (Chapter 6). We detected that sperm maturation does not occur under conditions of Ca2+ deficiency, suggesting that Ca2+ plays an essential role in this process (Chapter 7). During this maturation process, we observed a gradual decrease of spermatozoa sensitivity to environmental Ca2+. We found that testicular spermatozoa motility could be activated only when the Ca2+ concentration is high. Thus, we hypothesize that maturation process might be controlled by Ca2+ influx into the cell with subsequent loading of some Ca2+ stores. To our knowledge, these results provide, for the first time, evidence for the presence of Ca2+ stores in sturgeon spermatozoa. As a conclusion, the results of this study shed light on osmotic and ionic regulation of sperm motility in different fish species. The involvement of specific ions together with osmotic shock in fish spermatozoa maturation and aging were clarified. These findings broaden the possibilities of in vitro sperm manipulation in fisheries practice such as the use of sturgeon testicular spermatozoa, improvement of poor quality sperm in salmonids at the end of spawning season, and increase of carp sperm cryoresistance.

Keywords

ryby spermií, pohyblivost, zrání, iontový transport, osmoregulace, změny objemu, kryo-rezistence

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 9. 2015

Accessible from:: 3. 9. 2015

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery