Termodynamická analýza DNA po její modifikaci protinádorově účinnými látkami

Ing. Jakub Florián, Ph.D.

Doctoral thesis

Thermodynamic analysis of DNA modified by antitumor active compounds

Abstract:

Cisplatina náhodně objevena v roce 1965 týmem B. Rosenberga stále patří mezi nejpoužívanější cytostatika. Využívá se především k léčbě rakoviny varlat, vaječníků, krku a hlavy, větších plicních nádorů, a lymfomu. Léčba cisplatinou je spojena s výskytem závažných vedlejších účinků jako nauzea, ototoxicita, nefrotoxicita a hepatotoxicita. Mnohé nádory vykazují vůči cisplatině primární nebo získanou rezistenci. Závažné vedlejší účinky cisplatiny a výskyt rezistentních nádorů vedly k vývoji nových sloučenin a také k podrobnému studiu mechanismu působení cytostatik na rakovinou buňku. V této disertační práci byla použita diferenciální skenovací kalorimetrie ke studiu vlivu vazby platinových cytostatik na termodynamické vlastnosti DNA. V první části této disertační práce byla použita deferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) ke stanovení termodynamických změn spojených s translézovou syntézou přes léze DNA indukované cytostatikem oxaliplatinou (1,2-GG vnitrořetězcový můstek). Je-li DNA poškozena, mohou se v průběhu replikace nebo opravy objevit chyby v syntéze DNA. Mutageneze oxaliplatiny včetně některých aspektů vysvětlujících mechanismus již byly popsány použitím biochemických metod. Termodynamické aspekty chybovosti replikace však doposud nebyly stanoveny, stejně jako efekty dlouhého dosahu způsobené dominantními adukty oxaliplatiny na DNA (1,2-GG vnitrořetězcovými můstky). Výsledky naší práce dokazují vliv aduktu oxaliplatiny na termodynamické zvýhodnění vložení správného nukleotidu dCTP nad vložením nesprávného nukleotidu dTTP vkládaným naproti platinovaným guaninovým zbytkům. Bez léze je vložení komplementární báze (cytosinu) silně termodynamicky zvýhodněné nad vložením nekomplementární báze (thyminu) naproti 3' a 5' G. Přítomnost aduktu oxaliplatiny na 3' a 5' G vedla k významnému snížení tohoto termodynamického zvýhodnění. V druhé části disertační práce byl sledován vliv vnitrořetězcových můstků cytostatických dinukleárních PtII komplexů [{trans-PtCl(NH3)2}2-μ-{trans-(H2N(CH2)6NH2(CH2)2NH2(CH2)6NH2)}]4+ (1) a [{PtCl(DACH)}2-μ-{H2N(CH2)6NH2(CH2)2NH2(CH2)6NH2)}]4+ (2) (DACH je 1,2-diaminocyklohexan) na stabilitu DNA s důrazem na termodynamický původ této stability. Byly připraveny oligodeoxyribonukleotidové duplexy obsahující jeden (1,2), (1,3) nebo (1,5) vnitrořetězcový můstek na guaninových zbytcích v centrální TGGT, TGTGT nebo TGTTTGT sekvenci. Tyto duplexy byly podrobeny analýze s využitím DSC a pomocí chemických sond konformace DNA byla stanovena místa a rozsah konformačních distorzí. Navíc byla stanovena účinnost nukleotidové excizní opravy aduktů 1 a 2. Cílem bylo zjistit, zda by termodynamická destibilizace DNA způsobena adukty nemohla být použita jako prediktor účinnosti odstraňování těchto aduktů mechanismy nukleotidové excizní opravy. Tvorba vnitrořetězcových můstků 1 a 2 vedla k nepříznivým změnám volné energie duplexů. Termodynamická destabilizace duplexů způsobená přítomností aduktu závisela na počtu párů bází oddělující platinované báze. Trend byl (1,5) → (1,2) → (1,3) pro adukty 1 a (1,5) → (1,3) → (1,2) pro adukty 2. Schopnost aduktu snížit termodynamickou stabilitu DNA byla v korelaci s rozsahem konformačních distorzí DNA způsobených těmito adukty. Účinnost nukleotidové excizní opravy sledovala stejný trend. V třetí části disertační práce byla potvrzena cytotoxická aktivita organokovových sloučenin osmia a provedena detailní studie jejich interakce s DNA. Experimenty byly provedeny s následujícími sloučeninami: [(η6-bifenyl)Os(ethylendiamin)Cl]+ (o1), [(η6-bifenyl)Os(pikolinát)Cl] (o2), [(η6-p-cymen)Os(pikolinát)Cl] (o3) a [(η6-p-cymen)Os(oxinát)Cl] (o4). Cílem experimentů bylo objasnění mechanis

Abstract:

mu účinku výše uvedených cytostatik. Byla stanovena cytotoxicita námi testovaných sloučenin vůči buněčné linii lidské rakoviny vaječníku citlivé k působení cisplatiny (A2780) a mutantní linii se získanou rezistencí vůči cisplatině (A2780cisR). Dále byla stanovena akumulace komplexů uvnitř buněk. DNA je důležitý cíl většiny metalofarmak. Proto byly sérií biochemických a biofyzikálních in vitro experimentů studovány interakce sloučenin osmia s DNA. Komplexy o1-o3 vykazovaly vysokou cytotoxicitu vůči oběma buněčným liniím. Podstatně nižší aktivita o4 korelovala se značně nižším úhlem rozvíjení nadšroubovicové plazmidové DNA, ukazující na jiný způsob vazby sloučeniny na DNA.

Abstract:

Cisplatin, whose antitumor activity was serendipitously discovered by B. Rosenberg in 1965, is still widely used anticancer drug. Cisplatin is used for treatment of testicular, ovarian, cervical, head and neck, non-small cell lung tumors, and lymphoma. Cisplatin administration is followed by severe side effects such as nausea, ototoxicity, nefrotoxicity and hepatotoxicity. Many tumors exhibit inherent or acquired resistance to cisplatin. Severe side effects and resistance of many tumors led to design of new anticancer drugs and the in-depth drug mechanism studies. In the first part of this thesis differential scanning calorimetry (DSC) was used to measure the thermodynamic changes associated with translesion synthesis across major lesion induced in DNA by antitumor oxaliplatin (1,2-GG intrastrand cross-link). The mutagenic effects of oxaliplatin and some aspects of the underlying mechanism have been already explored by biochemical methods. However, the energetic involved in the mechanism of mutagenesis, such as the thermodynamic aspects of the replication fidelity and the long-range effects of oxaliplatin major DNA adducts (1,2-GG intrastrand cross-links) have not been examined. The results of the present work suggested the possibility to distinguish between correct dCTP and incorrect dTTP insertion opposite the guanine residues involved in the 1,2-intrastrand cross-link of oxaliplatin. Without the lesion, the addition of a matched dC base was clearly favored over insertion of dT across both 3' and 5' G, while with the 1,2-GG intrastrand cross-link of oxaliplatin under the same experimental conditions the addition of a matched dC base was clearly markedly less favored over insertion of dT across both 3' and 5' G in the cross-link. In the second part of this thesis the effects of major DNA intrastrand cross-links of antitumor dinuclear PtII complexes [{trans-PtCl(NH3)2}2-μ-{trans-(H2N(CH2)6NH2(CH2)2NH2(CH2)6NH2)}]4+ (1) and [{PtCl(DACH)}2-μ-{H2N(CH2)6NH2(CH2)2NH2(CH2)6NH2)}]4+ (2) (DACH is 1,2-diaminocyclohexane) on DNA stability were studied with emphasis on thermodynamic origins of that stability. Oligodeoxyribonucleotide duplexes containing the single 1,2, 1,3, or 1,5 intrastrand cross-links at guanine residues in the central TGGT, TGTGT, or TGTTTGT sequences, respectively, were prepared and analyzed by DSC and by chemical probes of DNA conformation. In addition, we also examined the efficiency of the mammalian nucleotide excision repair (NER) system to remove from DNA the intrastrand cross-links of 1 and 2 to further corroborate the thesis that thermodynamic destabilization of DNA by adducts of platinum compounds can be used as a predictor of the efficiency of repair mechanisms to remove the lesion from DNA. The unfolding of the platinated duplexes was accompanied by unfavorable free energy terms. The efficiency of the cross-links to thermodynamically destabilize the duplex depended on the number of base pairs separating the platinated bases. The trend was (1,5) → (1,2) → (1,3) cross-link of 1 and (1,5) → (1,3) → (1,2) cross-link of 2. The capability of the cross-links to reduce the thermodynamic stability of DNA correlated with the extent of conformational distortions induced in DNA by these cross-links. The nucleotide excision repair efficiency followed the same trend. The third part of this thesis is the in-depth study of osmium complexes binding to DNA and confirms the pharmacological activity of a new class of these anticancer metallodrugs. We investigated the interactions between the potential biological target DNA and four osmium(II) arene complexes – [(η6-biphenyl)Os(ethylenediamine)Cl]+ (o1), [(η6-biphenyl)Os(picolinate)Cl] (o2), [(η6-pcymene)Os(picolinate)Cl] (o3) and [(η6-p-cymene)Os(oxinate)Cl] (o4) - in an effort to understand their mechanism of action. We examined the cytotoxicity of osmium complexes toward both cisplatin-sensitive human ovarian (A2780) and resistant (A2780cisR) cancer cell lin

Abstract:

es and accumulation of complexes in these cells (cellular uptake). DNA is an important biological target for many metal-based anticancer agents. Hence, the interactions of polymeric DNAs with o1-o4 compounds in cell-free media were investigated by various biochemical and biophysical methods. Compounds o1-o3 display high cytotoxicity toward both cell lines. The markedly lower activity associated with complex o4 correlated with its lower unwinding of supercoiled plasmid DNA, indicating its different binding to DNA.

Keywords

Dinukleární platinová cytostatika, protinádorový, DNA adukt, diferenční skenovací kalorimetrie, nukleotidová excizní oprava, termodynamika, DNA polymerace, oxaliplatina

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 10. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 10. 1. 2012
• Supervisor: prof. RNDr. Viktor Brabec, DrSc.
• Reader: RNDr. Jiří Totušek, CSc., doc. RNDr. Oldřich Vrána, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Physics (4-years) / Biophysics