Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem v metabolomice a forenzní analýze

RNDr. Tomáš PLUHÁČEK

Disertační práce

ICP-MS in speciation analysis and metabolomics

Anotace:

Disertační práce se zabývá studiem nových možností aplikací laserové ablace ve spojení s hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem v klinické a forenzní analýze. Teoretická část disertační práce je věnována hmotnostní spektrometrii s indukčně vázaným plazmatem se zaměřením na analýzu prvků v biologických vzorcích. Jsou zde popsány základní principy hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem, rozklady biologických tkání, princip komerčně dostupných technik hmotnostně spektrometrického zobrazování se zaměřením na laserovou ablaci ve spojení s hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem. První část práce je zaměřena na multimodální zobrazování invazivní plicní aspergilózy (IPA) v kontrolních a infikovaných potkaních plicích. K zobrazování IPA infekce bylo využito PET/CT, LA-ICP-MSI, SEM-EDS, ale i standardního histologického vyšetření založeného na využití barvení dle Grocotta. Multimodální zobrazování umožnilo detailní studium masivně se rozšiřující infekce s následnou jednoznačnou lokalizací oblastí postižených IPA infekcí. LA-ICP-MS mapování distribuce stříbra a zlata specificky navázaného na mukopolysacharidové složky buněčné stěny Aspergillus fumigatus s velikostí laserového svazku 3-5 um poskytlo spolehlivý obraz rozšiřující se IPA infekce v plicní tkáni infikované houbou Aspergillus fumigatus. Masivní rozšíření IPA infekce bylo dále potvrzeno SEM-EDS jenž vzhledem ke svému submikrometrickému rozlišení umožnil získat morfologické detaily rozšíření hyf Aspergillus fumigatus napříč celou infikovanou plicní tkání. Druhá část práce se zabývá vývojem a následnou aplikací prostorových značek pro správný a přesný překryv molekulárních/prvkových map pro účely multimodálního a 3D zobrazování biologických tkání. Prostorové značky obsahující Rhodamin B, iontové stříbro a nanočástice zlata připravené v roztoku pHPMA polymeru se osvědčily pro vzájemné uspořádání molekulárních/prvkových map získaných prostřednictvím pětice doplňujících se zobrazovacích technik, a to MALDI-MSI, DESI-MSI, LA-ICP-MSI optické a fluorescenční mikroskopie. Třetí část se věnuje detailní analýze povýstřelových zplodin ulpělých na rukou střelce po použití střelné zbraně s následnou přímou identifikací osoby. LA-ICP-MS mapování Cu, Zn, Sb, Ba, Hg a Pb na povrchu latentních otisků poskytuje nejen obraz distribuce částic povýstřelových zplodin na povrchu otisku prstu, ale i možnost jejich klasifikace do příslušných tříd na základě prvkového profilu. Mimo to LA-ICP-MS zobrazování umožňuje i spolehlivou a přesnou rekonstrukci otisku prstu střelce, který tak může být přímo identifikován na základě vizuálního porovnání shody rozmístění papilárních linií a rozmanitých daktyloskopických markantů na 2D mapách distribuce Cu, Zn, Sb, Ba, Hg, Pb a kontrolním (referenčním) otisku. Poslední část disertační práce je zaměřena na studium vlivu obsahu celkového železa a mědi v myokardu na funkci srdečních mitochondrií během chronického srdečního selhání (ChSS). V rámci studie byla vyvinuta a validována ICP-MS metoda pro stanovení železa a mědi v biologických tkáních, která byla dále použita ke kvantitativnímu stanovení obou kovů ve vzorcích biopsií srdečních svalů odebraných pacientům s chronickým srdečním selháním během transplantace srdce prováděné v Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze. Kvantitativní ICP-MS stanovení odhalilo, že v případě pacientů s pokročilým ChSS došlo k výraznému snížení (~22 %) obsahu železa a mědi, které je spojeno se současným snížením aktivit enzymů citrátového cyklu, mitochondriální respirací a snížením exprese proteinů dýchac

Anotace:

ího řetězce. Kromě toho přítomnost myokardiálního deficitu železa přispívá k prohloubení mitochondriální dysfunkce spojené se sníženou substrátovou flexibilitou a odolností vůči oxidativnímu poškození reaktivními formami kyslíku.

Abstract:

This dissertation thesis is focused on new applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry in clinical and forensic analyses. The theoretical part of the thesis is devoted to the theoretical aspects of inductively coupled plasma mass spectrometry with focus to elemental analysis in various biological samples. In the next part, the principles of commonly used MSI techniques, especially laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry are discussed. The first part reports on multimodal imaging of an invasive pulmonary aspergillosis in control and infected rat lung tissue. PET/CT, LA-ICP-MSI, SEM-EDS and the standard histological evaluation employing Grocott's methenamine silver staining were used for the multimodal imaging of IPA infection. Multimodal imaging described the fungal burden in rats with a subsequent localization of the regions affected by the IPA infection. LA-ICP-MS imaging of silver and gold with 3-5 um laser foci combined with GMS staining provided a reliable image of fungal hyphae deposition in Aspergillus infected lung tissue. SEM-EDS with its submicrometric lateral resolution confirmed the presence of the massive aspergillosis and provided morphological details on hyphae spreading within the Aspergillus infected lung tissue. The second part of the thesis was focused on the development and application of fiducial markers for accurate alignment of individual molecular or elemental images in multimodal and 3D imaging of biological samples. Fiducial markers consisting of Rhodamine B, ionic silver and gold nanoparticles in a pHPMA solution were suitable for a correct fusion of molecular/elemental images obtained by five complementary imaging techniques, namely MALDI-MSI, DESI-MSI, LA-ICP-MSI, optical and fluorescence microscopy. The consecutive part of the thesis was aimed at analysing gunshot residues adhered onto the shooter's hands after firing followed by a subsequent identification of the shooter based on the dactyloscopic principle. LA-ICP-MS imaging of Cu, Zn, Sb, Ba, Hg and Pb on the latent fingerprints provided not only a detailed image of the gunshot residues distribution, but also the possibility of the gunshot residue classification based on a specific elemental profile. Moreover, the LA-ICP-MS imaging offered a reliable and correct reconstruction of shooter fingerprint, which could be directly identified based on the visual comparison of the consistency in the distribution of papillary lines and various dactyloscopic markers on the 2D images of Cu, Zn, Sb, Ba, Hg, Pb and the control (reference) fingerprint. The last part of the dissertation thesis studied the relationship between the myocardial iron content and mitochondrial function in human heart failure. The ICP-MS method for the determination of iron and copper in biological samples was developed and validated. The validated ICP-MS method was used for the determination of both metals in samples of failing myocardium that were obtained from patients undergoing transplantation at the Institute for Clinical and Experimental Medicine in Prague. The ICP-MS analysis revealed that myocardial iron and copper contents were systematically diminished (~22 %) in patients with heart failure. Moreover, decreased myocardial iron content was associated with a mitochondrial dysfunction, particularly with a reduced activity of citric acid cycle enzymes, reduced mitochondrial oxygen respiration, and reduced expression of mitochondrial respiratory chain enzymes. In addition, the presence of myocardial iron deficit contributed to worsening the mitochondrial dysfunction by altering substrate metabolism (i.e. by reducing substrate flexibility) and handling of reactive oxygen species.

Klíčová slova

Laserová ablace, hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem, multimodální zobrazování, invazivní plicní aspergilóza, prostorové značky, povýstřelové zplodiny, srdeční selhání

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 8. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Ing. Vladimír Havlíček, Dr.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Chemie / Analytická chemie