Identifikace bifidobakterií pomocí MALDI TOF hmotnostní spektrometrie

Kateřina Hepnarová

Bachelor's thesis

Identification of bifidobacteria by MALDI TOF mass spectrometry

Abstract:

Rod Bifidobacterium patří mezi bakterie dominantně zastoupené ve střevní mikrobiotě lidí a zvířat, především v období mléčné výživy. Jedná se o sacharolytické bakterie, které pro své příznivé účinky na zdraví hostitele našly uplatnění jako probiotika. Bifidobakterie byly objeveny již roku 1899, ale až roku 1924 byly identifikovány jako samostatný rod. V současné době je známo více než 80 druhů bifidobakterií od různých hostitelů. Vzhledem k narůstajícímu počtu a hostitelské variabilitě druhů náležejících do Bifidobacterium spp. je třeba pracovat na rychlých a spolehlivých metodách jejich identifikace. Cílem práce bylo ověřit funkčnost nově rozšířené databáze pro hmotnostní spektrometrii. Původní databáze od Bruker obsahovala 25 kmenů bifidobakterií. Tuto databázi se za spolupráce s BOKU v Vídni povedlo rozšířit o dalších 50 kmenů na celkem 75 kmenů. Dále bylo cílem identifikovat u zvířecích vzorků multihostitelské druhy.V této práci byly použity izoláty rodu Bifidobacterium ze sbírky Katedry mikrobiologie, výživy a dietetiky. Jednalo se o vzorky divokých kmenů od novosvětských opic lvíčka zlatého ze ZOO Olomouc. Dále pak byly použity i lidské vzorky. Celkem 144 testovaných vzroků bylo čersvě vykultivováno ze zramžených kultur. Pro kultivaci bylo využito tekuté modifikované Wilkins-Chalgren médium. Čistota narostlých kultur byla kontrolována pomocí světelného mikroskopu s fázovým kontrastem. Pro následnou identifikaci na MALDI-TOF MS byla použita metoda extrakce pomocí 70% mravenčí kyseliny a acetonitrilu. Vzorky byly vždy analyzovány ve dvou kopiích. Do výsledků práce byla zahrnuta kopie s vyšším identifikačním skóre.Z celkových 144 vzorků se podařilo identifikovat 115 z nich, tedy 79,8 %. Nejčastěji vyskytujícími se druhy byly B. adolescentis, B. longum, B. parmae, B. animalis a B. breve. U lvíčka zlatého se nepodařilo identifikovat všechny vzorky. Z 81 vzorků bylo identifikováno 52, což tvoří 64 %. Celkem bylo rozpoznáno 13 druhů bifidobakterií, z nichž byl nejčastějším druhem B. parmae. Lidských vzorků bylo celkem 63, z toho 32 od dospělých a 31 od kojenců. Tyto vzorky se podařilo identifikovat všechny, vykazovaly také vyšší skóre identifikace než vzorky od lvíčků. Celkem bylo identifikováno 9 druhů. Počet detekovaných druhů poukazuje na vyšší variabilitu zástupců rodu Bifidobacterium a čeledi Bifidobacteriaceae u lvíčka zlatého než u lidí. Z výsledků je patrné, že se cíle práce podařilo splnit. Díky rozšíření databáze se podařilo identifikovat celkem 19 druhů. Pokud by databáze nebyla rozšířena, podařilo by se pomocí základní databáze od Bruker identifikovat pouze 47 % z identifikovaných druhů, což je 9. Podařilo se nám také identifikovat multihostitelské druhy, které se vyskystovaly jak ve vzorcích lvíčka zlatého, tak i ve vzorcích od lidí. Jednalo se o 3 druhy – B. adolescentis, B. catenulatum a B. pseudocatenulatum.

Abstract:

Genus Bifidobacterium represents one of the main bacterial group in the intestinal microbiota of humans and animals, especially in the period of milk nutrition. Bifidobacteria are type of saccharolytic bacteria that are generally beneficial for host health due to their probiotic effect. Although bifidobacteria were discovered in 1899, they were not treated as separate genus before 1924. Currently, there are more than 80 species of bifidobacteria from various hosts that are known. As the number of species, as well as its host variability, has continuously been increasing, it is necessary to develop reliable methods for treir identification. The main goal of the thesis was to verify the functionality of the newly extended database for mass spectrometry. The original database created by Bruker contained 25 strains of bifidobacteria. This database was extended by 50 strains to the total number of 75 strains, in cooperation with the University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna. The additional goal was to identify multi-host species in animal samples. In the thesis, the verification was conducted using isolates of genus Bifidobacterium from a collection of the Department of Microbiology, Nutrition, and Dietetics. The collection contains samples of wild tribes of new world monkey, golden marmoset from the Olomouc ZOO as well as samples of human. In total, 144 tested samples were cultivated from frozen cultures. For the cultivation, the liquid modified Wilkins-Chalgren medium was used. The purity of the grown cultures was checked using a light microscope with phases contrast. The following identification conducted on MALDI-TOF MS used the extraction employing formic acid and acetonitrile. To achieve precise identification, the samples were analyzed twice. The outcome of the analysis with a higher identification score was included in the final results. Overall, 115 out of 144 samples were identified correctly, i.e. 79,8 %. The most common species were B. adolescentis, B. longum, B. parmae, B. animalis and B. breve. In the case of golden marmoset, 51 out of 81 samples were identified, corresponding to 64 %. Besides, 13 species of bifidobacteria species were determined correctly, mainly B. parmae. Regarding the identification of human samples, 32 were adult samples and 31 samples were from infants. All of 63 human samples were identified and indicated higher identification scores than samples from golden marmoset. Furthermore, 9 human species were identified. The number of detected species indicates higher variability of the genus Bifidobacterium and family Bifidobacteriaceae in the case of golden marmoset than in the case of humans. The results indicate that goal of the thesis was achieved. The newly extended database was valuable for identifying 19 species. In the case of using the database created by Brucker, only 47 % of the species would have been determined correctly. Furthermore, it was possible to identify multi-host species that occurred in both golden marmoset and human samples. Such multi-host species were B. adolescentis, B. catenulatum and B. pseudocatenulatum.

Keywords

Typový kmen, Spektrum, Databáze, Bifidobakterie, Identifikace

Keywords

Bifidobacteria, Type strain, Spectrum, Database, Identification

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Věra Neužil Bunešová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Agriculture, Horticulture and Rural Development / Nutrition and Foodstuffs