Vícerozměrné separační techniky pro analýzu metabolomu lidské moči

RNDr. Jaroslava JÁČOVÁ

Disertační práce

Multidimensional separation techniques in the analysis of human urine metabolome

Anotace:

Předkládaná disertační práce se zabývá instrumentálními analytickými metodami v metabolomice. Metabolomika je vědní disciplína umožňující detailní pohled na celkový profil nízkomolekulárních analytů (metabolitů) v biologických materiálech. Analytické nástroje proto musí čelit velké rozmanitosti a koncentračnímu rozsahu sledovaných analytů při vysoké komplexitě vzorků. V první části je vyvinut nový přístup přípravy vzorku na základě imobilizované ureasy, který umožňuje maximální zachování metabolomu moči při eliminaci obvyklých artefaktů a interferentů. Nově vyvinutá metoda je porovnána s relevantními již dříve publikovanými postupy (volnou ureasou, kyselou extrakcí do ethylacetátu) a vzorky ponechanými bez úpravy. Přístup založený na imobilizované urease je úspěšně aplikován na necílenou metabolomickou analýzu vzorků moči pacientů s dědičnou metabolickou poruchou - glutarovou acidurií typu I - a zdravých kontrol. V rámci zaměření na vícerozměrné separační metody, zejména GC×GC, je představen nový způsob škálování dvojdimenzionálního separačního prostoru, WOSEL (z angl. whole separation space scaling) založený na analytické metodě. Při aplikaci WOSEL je separační prostor ohraničen mrtvým časem na jedné straně a koncem separačního záznamu na straně druhé. Oproti tomu u tradičních přístupů je separační prostor zcela nebo z části definován retenčním časem analytů (nejvíce a nejméně zadržovaným analytem daného vzorku). Oba dříve publikované přístupy jsou proto závislé na vzorku použitém k optimalizaci. Při škálování pomocí WOSEL lze díky tomu s výhodou použít jakýkoli vzorek podobného typu. Navíc nedochází ke zkreslení separačního prostoru (i po škálování odpovídá vzhledu chromatogramu). Dále je pozornost věnována nalezení optimálního způsobu určení ortogonality dvojdimenzionálních chromatografických systémů. Je testováno celkem osm deskriptorů, které ortogonalitu počítají na základě odlišných principů. Žádný z deskriptorů ale není schopen ohodnotit homogenitu pokrytí (lokální ortogonalitu) a rozsah využitého separačního prostoru (globální ortogonalitu) najednou. Proto je pomocí geometrického průměru zkombinován nejlepší deskriptor lokální a globální ortogonality do nového deskriptoru nazývaného ASCA (z angl. AN and SC average), zahrnující oba aspekty ortogonality. Pomocí tohoto deskriptoru je nalezena optimální kombinace kolon pro GC×GC-MS analýzu metabolomu moči a plasmy.

Abstract:

The thesis deals with instrumental analytical methods in metabolomics. Metabolomics is a scientific discipline that focuses on the low molecular weight analytes (metabolites) contained in biological materials. Therefore, analytical tools must face the great diversity and concentration range of the analytes analyzed and high sample complexity. In the first part of the thesis, a new approach to sample preparation based on immobilized urease is developed, which allows maximum retention of urine metabolome by eliminating common artefacts. This newly developed method is compared with methods already published (free urease, acidic extraction into ethyl acetate) and samples left untreated. The approach based on immobilized urease has been successfully applied to the untargeted metabolomic analysis of urine samples from patients with the inherited metabolic disorder - glutaric aciduria type I - and healthy controls. Focused on multidimensional separation methods, especially GC × GC, a new method of scaling of a two-dimensional separation space, Whole Separation Space Scaling (WOSEL), is introduced. When using WOSEL, the separation space in both dimensions begins with the void time and ends with the last time point of data acquisition. Compared to WOSEL traditional scaling methods applies separation space delineated by the retention time of the most (and in one case least) retained sample analyte. Both previously published approaches are dependent on the sample used for optimization. In the case of WOSEL, any sample of a given (or similar) type of biological material can be used. Moreover, the space in which orthogonality is calculated corresponds to the perceived quality of the chromatogram (no separation space distortion occurs). Furthermore, attention is paid to finding the optimal way of determining the orthogonality of two-dimensional chromatographic systems. A total of eight descriptors are tested that calculate orthogonality based on different principles. However, none of the descriptors is able to evaluate the homogeneity of coverage (local orthogonality) and the extent of separation space used (global orthogonality) at once. Therefore, using the geometric mean, the best local and global orthogonality descriptor is combined into a new descriptor called ASCA (i.e. AN and SC average), encompassing both aspects of orthogonality. Using this descriptor, an optimal column combination for GC×GC-MS urine and plasma metabolome analysis is evaluated.

Klíčová slova

metabolom, moč, příprava vzorku, ureasa, dvojrozměrné separace, GC×GC, optimalizace, ortogonalita, škálování

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 6. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. RNDr. Tomáš Adam, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Chemie / Analytická chemie