Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Bc. Lenka Činčárová, Ph.D.

Diplomová práce

The roles of mutant p53 protein interactions with DNA

Anotace:

Protein p53 patří mezi nádorové supresory, které hrají důležitou roli v regulaci buněčného cyklu a v prevenci nádorového bujení. Mutace v genu TP53 jsou spojeny se vznikem více než 50 % lidských maligních nádorů. Skupina mutantních proteinů p53 je extrémně různorodá, a to jak na úrovni funkční tak strukturní, a poodhalil buněčné aktivity, které nejenže se liší od funkcí standardního proteinu, ale také mezi mutantními proteiny navzájem. Cílem našeho studia bylo odhalit souvislost mezi vazbou mutp53 na DNA a její funkcí v gliomových liniích. Charakterizovali jsme gliomové linie z hlediska mutace v genu TP53 a polymorfizmu v kodonu 72. Zjistili jsme, že vybrané linie obsahují bodové mutace R273C (Onda11) a G245S (Onda10). Linie U251 a Onda11 exprimují protein mutp53 s argininem v pozici 72, pouze Onda11 s prolinem. Všechny tři linie jsou pro danou alelu homozygotní. Podařilo se nám klonovacími metodami připravit vektory pro produkci rekombinantních proteinů mutp53 s mutacemi G245S, R273H, R273C a R248W v E.coli. Prokázali jsme, že mutantní rekombinantní proteiny G245S, R273H a R273C se váží k lineární DNA in vitro. Schopnost rozpoznat p53CON sekvenci ve fragmentu o délce 500bp si ponechali pouze rekombinantní proteiny R273H a G245S. Genomovou DNA z intronových oblastí genů DOCK1 a MLL3 rozpoznává sekvenčně specificky v lineární formě mutantní protein R273H. Dopad této vazby na expresi zmíněného genu DOCK1 byl prokázán pomocí metod siRNA a RT-PCR. Gen DOCK1 byl specificky aktivován mutantním proteinem p53 R273H v buňkách linie U251 a mutp53 G245S v Onda 10. V buňkách linie Onda11 k aktivaci genu DOCK1 mutantním p53 R273C nedošlo. Získané výsledky korelují s výsledky studia vazby těchto proteinů na DNA a také s charakterem této sekvence. Pomocí počítačové analýzy programem MAR-Wiz jsme zjistili, že genomový fragment obsahující intronovou oblast genu DOCK1 je potenciálním MAR/SAR elementem.

Abstract:

Protein p53 is a tumor suppressor. It plays an important role in prevention of tumorigenesis. Mutation in the gene TP53 are conected with more than 50% of malignant tumors. The group of mutant p53 is very heterogenous in both structures and function and show the variance in the cellular activities of mutant proteins itself and between wtp53 and mutp53 as well. The goal of our study was to characterize DNA binding of mutant protein p53 and its consequences in glioma cell lines. First we characterized the mutation (in exons 7 and 8) and the codon 72 polymorphism in gene TP53 of each glioma line. We found out, that the examinant glioma lines contain theses point mutation: R273C (Onda11) and G245S (Onda10). The glioma lines U251 and Onda11 express mutp53 with arginin in codon 72, only mutp53 of Onda11 contains prolin in codon 72. Each of the glioma lines is homozygous in this codon. We succeeded in preparation of vectors for production of recombinant proteins with these mutations: G245S, R273H, R273C and R248W. We demonstrated the binding of recombinant proteins mutp53 G245S, R273H and R273C to linear DNA in vitro. Only R273H and G245S proteins were able to bind to 500bp long fragment of DNA with p53CON sequence-specifically. Protein R273H retained the ability of sequence-specific binding to intron fragments of the DOCK1 and MLL3 genes. The consequence of this binding was demonstrated by siRNA and RT-PCR methods. DOCK1 gene was activated specifically by mutant protein p53 R273H in glioma cell line U251 and G245S in Onda10. There was no evidence of this activation by mutp53 R273C in Onda11. This observation correlates with our previous findings of the binding ability of these proteins to DNA and with the character of this sequence. We analyzed the genomic fragment of intron region of DOCK1 gene by MAR-Wiz program and we found out that this sequence is potentially part of MAR/SAR element.

Klíčová slova

gliomas, mutp53, polymorfism, codon 72, mutp53 R273C, R273H, G245S, MAR/SAR, sequence-specific binding, structure-selective binding, ChIP

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 5. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 2. 2008
• Vedoucí: Mgr. Marie Brázdová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika