Heterologní exprese cryptogeinu K13V a testování jeho biologické aktivity

Bc. Vojtěch Pětroš

Bachelor's thesis

Heterologous expression of K13V cryptogein and testing of its biological activity

Abstract:

Kryptogein je malý protein patřící do skupiny elicitinů, sekretovaný oomycetou Phytophora cryptogea, který vyvolává obrannou reakci a rezistenci u celé řady rostlinných druhů. V rámci bakalářské práce byla exprimována mutantní varianta kryptogeinu K13V, u které došlo k záměně lysinu za valin na 13. pozici. Tato aminokyselinová záměna narušuje vlastnosti hydorfóbní kavity proteinu, kterou protein využívá k transportu sterolů a mastných kyselin. Exprese probíhala v expresním systému kvasinky Pichia pastoris, která je schopna eukaryotní exprese a správného složení proteinu. Po aplikaci mutantní varianty do rostlin tabáku se sledovaly tři hlavní faktory, a to akumulace transkriptů genů PR proteinů, míra buněčné nekrózy a schopnost přenosu sterolů, jako indikátorů biologické aktivity proteinu. Varianta K13V měla oproti kryptogeinu, silně omezenou schopnost přenášet steroly mezi membránami a indukovat nekrózu při aplikaci přes petiolu. Na druhé straně indukce nekrózy po přímé infiltrace do listu nebyla u této varianty výrazně ovlivněna, stejně jako její schopnost exprese vybraných PR proteinů při obou metodách aplikace.

Abstract:

Cryptogein is a small protein belonging to the group of elicitins secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea. In plants, cryptogein is able to induce defence reaction and systemic acquired resistance. In this thesis cryptogein mutant K13V carrying substitution of lysine residue 13 for valine residue was prepared. This mutation disturbs proteins hydrophobic cavity able to transport sterols and fatty acids Expression of the protein was done in yeast Pichia pastoris which is capable of eukaryotic expression and folding of the protein to its correct form. After application of this mutant variant into tobacco plants three basic factors were observed; accumulation of transcripts for PR proteins, level of the cell necrosis and capability to transfer sterols as an indicators of its biological activity. Compared with cryptogein variant K13V had a significantly reduced sterol transfer ability between membranes and ability ti induce necrosis after petiole application. On the other hand, induction of necrosis after direct infiltration of K13V protein to leaves was not changed as well as its ability to express selected PR protein in both methods of application.

Keywords

Kryptogein, mutant K13V, Elicitiny, PR proteiny, Obranné mechanismy rostlin

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 13. 6. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Jan Lochman, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry