Fyzické mapování Ph2 regionu u pšenice seté

Mgr. Radim SVAČINA

Disertační práce

Physical mapping of Ph2 region in hexaploid wheat

Abstract:

Bread wheat (Triticum aestivum L.) is one of the most essential cultivated crops around the globe. It is a staple food for about 40 % of population and together with corn and rice constitutes the bedrock of plant agriculture. Hexaploid wheat emerged from two distinct hybridization events among three diploid species, thus giving rise to its three subgenomes A, B and D. Consequently, its genome has a huge size (~ 16 Gb) with a high content of repetitive sequences (85 %), making the identification of genes with agronomical value a challenging task. However, such complex nature of hexaploid wheat allows a creation of various aneuploid stocks, missing fragments or even entire chromosomes, creating an opportunity to facilitate gene cloning. The existence of three homoeologous sets of chromosome in bread wheat genome generate a vulnerability towards incorrect chromosome pairing during meiosis, endangering the creation of healthy gametes and thus its fertility. Consequently, as many other polyploid species, wheat developed a genetic control of correct chromosome pairing which is being regulated by Pairing homoeologues (Ph) genes. The most significant gene of this group is located on the chromosome 5B and is called Ph1 which was recently indetified as TaZIP4-B2. A different gene with a lower effect on chromosome pairing was mapped through use of radiation mutant ph2a to a distal 121 Mb of the short arm of chromosome 3D and is called Ph2. Together with Ph3 and some other minor genes, they contribute to correct chromosome pairing and recombination during meiosis. Usually, genes are kept in a population by being beneficial to its host or through high linkage to this gene, however there are known exceptions, such as gametocidal genes. The gametocidal genes ensure inheritance through induction of genomic aberrations to gametes lacking them, causing total or partial sterility. In hexaploid wheat, chromosomes containing gametocidal genes are being used for creation of mostly terminal chromosome deletion lines that can be utilized as material for various purposes. The main goal of this thesis was the use of terminal deletion lines of chromosome 3D to delimit the Ph2 gene location with subsequent selection of candidate gene(s) and their functional validation using TILLING population. Novel 113 deletion lines for chromosome 3D were developed and subsequently screened by 84 markers alongside the entire chromosome length to determine the deletion size. The deletion lines in the area of interest were crossed with rye and phenotyped for Ph2 gene presence. Through this approach, we delimited the Ph2 gene locus from original 121 Mb to 12.3 Mb region of the short arm of chromosome 3D, reducing the number of potential candidate genes from 1577 to 88. Out of these 88 genes, only a single one was mutated in EMS-induced ph2b mutant. This gene encodes a DNA mismatch repair protein TaMSH7-3D. TILLING population of bread wheat 'Cadenza' cultivar carrying EMS-induced point mutations was exploited for selection of seven mutants of TaMSH7-3D gene. These mutants were crossed with Aegilops variabilis, showing a similar Ph2 deleterious phenotype. Through this study, we show that Pairing homoeologous 2 encodes a mismatch repair protein TaMSH7-3D, thus solving a half-century-old question.

Abstract:

Pšenice setá (Triticum aestivum L.) je jednou z nejdůležitějších kultivovaných plodin na světě. Jedná se o základní potravinu pro přibližně 40 % lidské populace a spolu s kukuřicí a rýží tvoří základ rostlinné výroby. Hexaploidní pšenice vznikla na základě dvou různých hybridizací mezi třemi diploidními druhy, jež daly původ jejím třem subgenomům A, B a D. Následkem toho má její genom značnou velikost (~ 16 Gb) s vysokým obsahem repetitivních sekvencí (85 %), což činí identifikaci agronomicky významných genů složitým úkolem. Takto složitá struktura pšeničného genomu však umožňuje tvorbu různých aneuploidních linií, usnadňujících klonování genů. Existence tří homoeologních sad chromozomů pšenice seté s sebou nese náchylnost k nesprávnému chromozomálnímu párování během meiozy, což potenciálně ohrožuje tvorbu zdravých gamet, a tudíž i fertilitu. Proto si pšenice, jako mnoho jiných polyploidních druhů, vyvinula genetickou kontrolu správného chromozomálního párování, která je regulována "Pairing homoeologous" (Ph) geny. Nejdůležitější gen této skupiny, který se nazývá Ph1, se nachází na chromozomu 5B, a byl nedávno identifikován jako TaZIP4-B2. Další gen, s nižším vlivem na chromozomální párování, byl mapován pomocí radiačního mutanta ph2a na distálních 121 Mb krátkého ramene chromozomu 3D a je nazývám Ph2. Společně s Ph3 a dalšími minoritními geny přispívají ke správnému chromozomálnímu párování a rekombinaci během meiozy. Geny jsou obvykle udržovány v populaci v důsledku jejich prospěšnosti hostiteli nebo vysokou vazbou na takový gen, nicméně jsou známy výjimky jako například gametocidní geny. Gametocidní geny si zajišťují svůj přenos do potomstva díky tvorbě genomických aberací v gametách, do kterých nebyly přeneseny, což způsobuje jejich úplnou nebo častečnou sterilitu. U hexaploidní pšenice se chromozomy obsahující gametocidní geny využívají při tvorbě delečních linií, které mohou být použity jako materiál pro různé aplikace. Hlavní cíl této práce bylo využití delečních linií chromozomu 3D pro mapování genu Ph2 s následnou selekcí kandidátních genů a jejich funkční validací pomocí TILLING populace. Bylo vytvořeno 113 nových delečních linií, které byly následně testovány 84 markery po celé délce chromozomu, pro zjištění velikosti delece. Přítomnost genu Ph2 byla analyzována křížením delečních linií s žitem a jejich fenotypováním. Tímto přístupem byl Ph2 gen zamapován do regionu o velikosti 12,3 Mb, oproti původním 121 Mb krátkého ramene chromozomu 3D. Množství potenciálních kandidátních genů bylo sníženo z 1577 na 88. Jen jediný z identifikovaných 88 genů nese deleci v EMS mutantovi ph2b. Tento gen kóduje 'DNA mismatch repair' protein TaMSH7-3D. Sedm mutantů tohoto genu bylo vybráno z TILLING populace pšeničného kultivaru 'Cadenza' nesoucí bodové mutace. Tito mutanti byli kříženi s Aegilops variabilis, kdy analýza fenotypu Ph2 odpovídala jeho delečnímu projevu. Touto studií bylo prokázáno, že Pairing homoeologous 2 kóduje 'DNA mismatch repair' protein TaMSH7-3D, čímž byla zodpovězena půl století nevyřešená otázka.

Keywords

Pšenice setá, Triticum aestivum, Pairing homoeologues, Ph2, deleční linie, gametocidní

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 10. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 1. 2021
• Vedoucí: Mgr. Jan Bartoš, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie