Bioinformatická analýza a design halogenalkandehalogenas

Mgr. Eva Chovancová, Ph.D.

Disertační práce

Bioinformatic analysis and design of haloalkane dehalogenases

Anotace:

Halogenalkandehalogenasy jsou enzymy se širokou substrátovou specificitou, které katalyzují hydrolytický rozklad řady halogenovaných uhlovodíků, včetně významných polutantů životního prostředí. Cílem této práce bylo: (i) rozšířit dosavadní znalosti o halogenalkandehalogenasach o informace týkající se evolučních a funkčních vztahů mezi jednotlivými členy této rodiny a (ii) vyvinout dva bioinformatické nástroje pro racionální design enzymů s vylepšenými katalytickými vlastnostmi. Na základě fylogenetické analýzy byla rodina halogenalkandehalogenas rozdělena do tří podrodin, z nichž jedna nebyla dosud v literatuře pospána. Pro tuto podrodinu byl předpovězen nový typ katalytické pentády. Studie dále zmapovala hlavní evoluční události, které vedly k vývoji současných halogenalkandehalogenas, a to změnu katalytických reziduí a přestavbu víčkové domény. Jako oblast důležitá pro adaptaci halogenalkandehalogenas k novým substrátům byla předpovězena N-koncová část víčkové domény a také přístupové tunely. Fylogenetická klasifikace, která byla zavedena v této studii, umožňuje rychlou a přesnou identifikaci nových členů rodiny v sekvenčních databázích. Cílem navazujícího projektu bylo zjistit, zda je možné využít fylogenetickou klasifikaci pro předpověď substrátové specificity nových halogenalkandehalogenas. Na základě porovnání evolučních a funkčních příbuzností devíti halogenalkandehalogenas se ukázalo, že extrapolace funkčních vlastností není pro tyto enzymy možná. Studie rovněž umožnila nalézt vhodné substráty pro testování aktivity nových halogenalkandehalogenas a potvrdila důležitý vliv dutiny aktivního místa a přístupových tunelů na substrátovou specificitu těchto enzymů. V rámci této disertační práce byla dále vyvinuta nová verze programu CAVER pro analýzu přístupových tunelů v proteinech. CAVER 3.0 nově umožňuje systematickou analýzu tunelů v dynamických systémech. Informace o dynamickém chování tunelů jsou totiž klíčové jak pro vyhodnocení biologické relevance identifikovaných tunelů, tak pro studium mechanizmů řídících otevírání a zavírání tunelů. Cílem mnoha experimentů proteinového inženýrství je vytvoření enzymů s vylepšenou aktivitou, enantioselektivitou či novou substrátovou specificitou. Pro tyto účely se často využívá modifikace velikosti, tvaru a fyzikálně-chemických vlastností přístupových tunelů a dutiny aktivního místa. Tato strategie byla rozšířena o odhad mutability jednotlivých pozic proteinu a implementována do webového nástroje HotSpot Wizard. HotSpot Wizard integruje strukturní, funkční a evoluční informace z řady bioinformatických databází a nástrojů a na základě těchto informací vybírá pozice vhodné pro inženýrství katalytických vlastností enzymu. Porovnání s publikovanými daty potvrdilo, že mutageneze zacílená do míst identifikovaných nástrojem HotSpot Wizard vede ke změně katalytických vlastností enzymů a poskytuje větší podíl funkčních variant než mutageneze náhodná.

Abstract:

Haloalkane dehalogenases are broad-specificity enzymes catalyzing the hydrolysis of numerous halogenated hydrocarbons, including environmental pollutants. The aim of this Thesis was to: (i) extend the knowledge about this environmentally important family of enzymes by information about the evolutionary and functional relationships among its members and (ii) develop two bioinformatics tools facilitating the rational design of enzymes with improved catalytic properties. Phylogenetic analysis suggested subdivision of haloalkane dehalogenases into three subfamilies, of which one comprised exclusively putative members. A novel type of the catalytic pentad composition was predicted for this new subfamily. The main evolutionary events of haloalkane dehalogenases, i.e., the repositioning of the catalytic pentad residues and the change of the composition of the cap domain, were elucidated. The N-terminal part of the cap domain and the access tunnels were proposed as important sites for the adaptation of haloalkane dehalogenases to the new substrates. The established phylogenetic classification enables effective identification of new putative family members in the sequence databases. The follow-up study investigated the possibility to use the phylogenetic classification also for prediction of the substrate specificity of putative haloalkane dehalogenases. Comparison of the substrate specificity profiles of nine haloalkane dehalogenases with the phylogenetic data revealed that such extrapolation is not possible for these enzymes. Additionally, this study defined substrates suitable for routine screening for the haloalkane dehalogenase activity and confirmed that the active site cavity and the access tunnels are important, yet not the only determinants of haloalkane dehalogenase substrate specificity. To facilitate the analysis of the access tunnels in haloalkane dehalogenases as well as other proteins, a new version of the CAVER software was developed. CAVER 3.0 enables systematic analysis of tunnels in molecular dynamics simulations, which is essential for assessing the reliability of identified tunnels or identification of tunnel gating mechanisms. Modification of the size, shape and physico-chemical properties of the access tunnels and the active site cavity represents a common protein engineering strategy for construction of enzymes with improved activity, enantioselectivity or novel substrate specificity. This strategy was extended by the procedure estimating mutability of individual residues and implemented into the web server HotSpot Wizard. HotSpot Wizard integrates structural, functional and evolutionary information obtained from several databases and tools and selects positions suitable for engineering of enzyme catalytic properties. Comparison of the identified hot spots with the literature data confirmed that the mutagenesis targeting the hot-spot positions leads to modulation of the catalytic properties of enzymes and provides a higher proportion of viable variants than the random mutagenesis.

Keywords

bioinformatics, evolution, enzyme, rational design, substrate specificity, tunnel, haloalkane dehalogenase bioinformatika, evoluce, enzym, racionální design, substrátová specificita, tunel, halogenalkandehalogenasa

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 9. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 9. 2011
• Vedoucí: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.
• Oponent: Mgr. Marian Novotný, Ph.D., Ing. Štefan Janeček, DrSc., RNDr. Jiří Vondrášek, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Chemie (čtyřleté) / Chemie životního prostředí