Biočipy pro afinitní stanovení

Mgr. Matěj Pastucha, Ph.D.

Doctoral thesis

Biochips for affinity assays

Abstract:

Imunochemická stanovení a imunosensory jsou široce využívané v klinické diagnostice, sledování bezpečnosti potravin, monitorování životního prostředí, či detekci biologických zbraní. Afinitní interakce protilátky s antigenem zajišťuje vysokou citlivost a specificitu i v komplexních vzorcích. Imunostanovení jsou většinou prováděna v laboratoři, a jsou známa pro svou robustnost a citlivost. Imunosensory jsou typem biosensoru, který na určitém fyzikálně-chemickém převodníku integruje vazbu analytu na protilátku, generování signálu i jeho měření. Tímto lze analýzu provést rychleji, jednodušeji a levněji, s nižšími nároky na přístrojové vybavení a obsluhu. To často umožňuje nasazení senzoru mimo laboratoř – přímo v místě potřeby měření, nebo v oblastech/aplikacích s omezenými zdroji. Práce poskytuje teoretický úvod k imunostanovením – jsou diskutovány protilátky, imunostanovení, možnosti značek a multiplexních uspořádání, včetně aktuálních pokroků v těchto oblastech. Dále práce poskytuje úvod k imunosensorům založeným na resonanci povrchových plasmonů (SPR) a elektrochemii, a metodám detekce bakterií. Experimentální část je reprezentována recenzovanými články popisujícími vývoj několika inovativních imunoafinitních stanovení a sensorů pro detekci patogenních bakterií. Lidská patogenní bakterie Salmonella Typhimurium byla detekována pomocí impedanční spektroskopie (EIS), což umožňuje rychlou analýzu bez potřeby značky. Vysoce citlivá laboratorní metoda pro detekci této bakterie poté byla realizovaná pomocí SPR biosensoru se zesílením signálu pomocí enzymatické precipitační reakce. Elektrochemická detekce byla uplatněna také v amperometrickém biosensoru pro detekci bakterie Melissococcus plutonius, původce včelího onemocnění hniloba včelího plodu. A nakonec, pro detekci této bakterie a bakterie Paenibacillus larvae, původce závažnějšího moru včelího plodu, bylo vyvinuto destičkové imunostanovení využívající foton-upkonverzní nanočástice UCNPs) jako luminiscenční značku pro zvýšení citlivosti. Dále byl v přehledovém článku shrnut poslední vývoj, trendy a výzvy v aplikacích magnetických mikro- a nanočástic ve vývoji elektrochemických imunostanovení.

Abstract:

Immunochemical assays and immunosensors are widely applied in medical diagnostics, food safety, environmental monitoring, or detection of biological warfare agents. The antibody–antigen affinity provides specific and sensitive recognition of the analyte even in complex samples. Immunoassays are usually intended for laboratory applications; they are known for high robustness and sensitivity of the detection. Immunosensors, a type of biosensors, combine the immunoassay with a physicochemical transducer, that integrates the molecular recognition with signal generation and its measurement in one device. This renders the analysis quicker, simpler, cheaper, decreasing demands on instrumentation and operators, often allowing point-of-care/need use or application in resource-limited settings. The theoretical part of the thesis provides general introduction to immunoaffinity assays – covering antibodies, immunoassays, labeling possibilities, and multiplexing solutions, and recent advances in these fields are discussed. Furthermore, surface plasmon resonance and electrochemical immunosensors, and methods for bacteria detection are described. The experimental part is represented by peer-reviewed research articles describing development of several novel immunoaffinity assays and sensors for detection of pathogenic bacteria. Human foodborne pathogen Salmonella Typhimurium was detected by impedance spectroscopy (EIS) to allow rapid label-free point-of-need measurement. Highly sensitive method for detection of Salmonella was realized by a surface plasmon resonance biosensor with signal enhancement provided by enzyme-catalyzed precipitation reaction. Electrochemical detection of Melissococcus plutonius, the causative agent of honeybee disease European foulbrood, is also presented. Finally, photon upconversion nanoparticles (UCNPs) were applied as luminescent labels to increase sensitivity in microtiter plate-based immunoassays for Melissococcus plutonius and Paenibacillus larvae (causative agent of American foulbrood, another serious honeybee disease). Furthermore, recent progress, trends, and challenges in the application of magnetic nano- and microparticles in electrochemical immunoassays were covered in the appended review article.

Keywords

Imunochemická detekce, Imunostanovení, Imunosensor, Biosensor, Protilátka, Detekce bakterií, Nanočástice, Elektrochemie, SPR, ELISA, ULISA, Immunochemical detection, Immunoassay, Immunosensor, Antibody, Bacteria detection, Nanoparticle, Electrochemistry

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 27. 6. 2024
• Supervisor: prof. RNDr. Petr Skládal, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Lucie Korecká, Ph.D., pplk. gšt. prof. RNDr. Miroslav Pohanka, Ph.D., DSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry