Využití elektrochemických metod při studiu proteinů

Mgr. David NOVÁK

Disertační práce

The Use of Electrochemical Methods in Protein Study

Anotace:

Disertační práce je zaměřena na vyzkum oxidačně-redukčních přeměn proteinů. Byl zkoumán cytochrom c izolovany z koňského a telecího srdce. Z těchto vzorků byl dále připraven apocytochrom c a porfyrincytochrom c, jejichž oxidačně-redukční chování bylo porovnáno s nativním proteinem. Elektrochemická data byla doplněna o vysledky elektronové paramagnetické rezonanční spektroskopie (EPR) a imunochemické analyzy. Kromě proteinů, které jsou dobře rozpustné ve vodném prostředí, jsem dále zkoumal membránové proteiny Na+/K+ ATPázu a Ca2+ ATPázu. Na+/K+ ATPasa byla izolována z vepřovych ledvin a modifikována methylglyoxalem (MGO). Následné strukturní změny byly detegovány elektrochemicky a pomocí peptidového mapování byly identifikovány konkrétní modifikace aminokyselinovych (aa) zbytků. Byl také pozorován inhibiční účinek MGO na enzym solubilizovany pomocí detergentu i inkorporovany do liposomů. Vliv dikarbonylovych vedlejších produktů metabolismu byl také zkoumán u Ca2+ ATPasy izolované z králičího svalu. Zde byla porovnána inhibiční aktivita tří látek. Látky jsou seřazeny od nejsilnějšího inhibičního účinku, methylglyoxal >> glyoxal > 3-deoxyglukoson. Pro vyše uvedené studie byla využita chronopotenciometrická rozpouštěcí analyza konstantním proudem s rtuťovou kapkovou visící pracovní elektrodou. Sledováno bylo katalytické vylučování vodíku, za které odpovídají Cys, Lys, Arg, His aminokyselinové zbytky. Katalytické vylučování vodíku bylo také pozorováno u His obsahujících peptidů označovanych jako "H-drátky". U peptidu Ala3-(His-Ala2)6 byla zjištěna stabilizace -helikální struktury trifluorethanolem. Tyto vysledky byly potvrzeny pomocí NMR a CD spektrometrií. V závěrečné fázi doktorského studia byly zkoumány klinické vzorky pacientů. Byl izolován lidsky sérovy albumin (HSA) z krve zdravych jedinců a měřena jeho elektrokatalytická aktivita. Interindividuální variabilita ve vzorcích izolovanych z krve zdravych jedinců vztažená na komerčně dostupny standard HSA pomocí variačního koeficientu, ktery byl 8,5 %. Tato hodnota byla vypočítána z rozdílů v elektrochemické odezvě vzorků izolovaného HSA od jednotlivych dárců. Také byla zkonstruována průtočná elektrochemická cela s pracovní elektrodou vyrobenou z uhlíkového mikrovlákna. Pomocí této techniky byl sledován ampérometricky signál vzorků lidského séra odrážející celkovou antioxidační (elektron-donorovou) kapacitu jednotlivych vzorků.

Abstract:

The dissertation thesis is focused on the research of redox transformations of proteins. Cytochrome c isolated from the horse and calf heart were investigated. Apocytochrome c and porphyrincytochrome c were further prepared. Then redox behaviors of modified cytochromes c were compared with the native protein. Electrochemical data were supplemented with results of electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) and immunochemical analysis. In addition to proteins that are well soluble in aqueous media, I also studied the membrane proteins Na+/K+ ATPase and Ca2+ ATPase. Na+/K+ ATPase was isolated from pork kidneys and modified with methylglyoxal (MGO). Subsequent structural changes were detected electrochemically and, specific modifications of amino acid residues were identified using peptide mapping. The inhibitory effect of MGO on both detergent solubilized and incorporated enzymes into liposomes was also observed. The effect of dicarbonyl by-products of metabolism has also been investigated in Ca2+ ATPase isolated from rabbit muscle. Here the inhibitory activity of three compounds were compared. Inhibitory activity was ranked from strongest to weakest: methylglyoxal >> glyoxal > 3-deoxyglucosone. For the above studies, constant current chronopotentiometric striping analysis with a mercury electrode was used. Catalytic hydrogen evolution was monitored. Lys, Arg, His and Cys residues are responsible for this electrochemical process. Catalytic hydrogen evolution has also been observed in His-containing peptides referred to as "H-wires". In peptide Ala3-(His-Ala2)6, stabilization of its -helical structure by trifluoroethanol was observed. These results were further confirmed using NMR and CD spectroscopy. Finally, clinical samples of healthy volunteers were examined. Human serum albumin (HSA) was isolated from the blood of healthy volunteers and its electrocatalytic activity was measured. The interindividual variability in samples isolated from healthy volunteers in comparison with the commercially available HSA standard was determined by variation coefficient 8.5 %. This value was calculated from differences in the electrochemical responses of isolated HSA samples from each healthy volunteer. An electrochemical cell for flow injection analysis with a working electrode made of carbon microfiber was also constructed. Using this technique, the amperometric signal of human serum samples was monitored and the total antioxidant capacity of individual samples was evaluated.

Klíčová slova

proteiny, elektrochemie, analyza proteinů, izolace proteinů, purifikace proteinů

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 7. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Ing. Jan Vacek, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská chemie a klinická biochemie / Lékařská chemie a klinická biochemie