Průkaz a stanovení vybraných amatoxinů ve vzorcích s biologickou matricí

Bc. Veronika SAPAROVÁ

Master's thesis

Detection and determination of selected amatoxins in samples with biological matrix

Abstract:

Tato diplomová práce se zabývá problematikou houbových otrav především faloidního typu, které jsou způsobeny požitím muchomůrky zelené. Teoretická část diplomové práce popisuje různé druhy otrav, toxiny způsobující otravu organismu a také množství metod, které již byly vyvinuty za účelem rychlého a spolehlivého stanovení houbových toxinů. Praktická část diplomové práce se zaměřuje na vyvinutí rychlé a jednoduché LC-MS metody pro stanovení amatoxinů muchomůrky zelené a to konkrétně alfa-amanitinu a beta-amanitinu. K tomuto účelu bylo použito spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotností detekcí využívající trojitý kvadrupól. V praktické části je zahrnuta také extrakce a stanovení těchto toxinů v muchomůrce zelené, v houbové polévce a v moči. Vzorky moče byly spikovány alfa-amanitinem na koncentraci 5 ng/ml. Kvantifikace amatoxinů probíhala metodou kalibrační křivky sestrojené za použití kyseliny dinitrobenzoové jako interního standardu. Extrakce analytů byla provedena na SPE kolonkách. Použitím dipeptidu při SPE se zvýšila návratnost amatoxinů na 94 %. Metoda je dostatečně citlivá jak pro stanovení amatoxinů například ve zbytcích potravy, tak v moči, kde je obsah amatoxinů nižší. Alfa-amanitin byl derivatizován dansyl-chloridem za účelem zvýšení odezvy. Bylo zjištěno, že derivatizace nemá významný vliv na odezvu alfa-amanitinu. Metodou bylo dosaženo meze detekce 5 ng/ml pro alfa-amanitin a 10 ng/ml pro beta-amanitin. Mez kvantifikace byla stanovena na 30 ng/ml pro alfa-amanitin a 100 ng/ml pro beta-amanitin.

Abstract:

This diploma thesis deals with mushroom poisoning especially of faloidic type which is caused by ingestion of Amanita phalloides. The theoretical part of the thesis describes various types of poisoning, toxins which cause poisoning of an organism and also a lot of methods that have been developed for rapid and reliable determination of fungal toxins. Experimental part of the thesis aims to develop rapid and simple LC-MS method for the determination of amatoxins of Amanita phalloides namely alfa-amanitine and beta-amanitine. This was achieved by employing high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection using a triple quadrupole analyser. The experimental part also includes the extraction, determination and quantification of these amatoxins in Amanita phalloides, mushroom soup and urine. The urine samples were spiked with alfa-amanitine at a concentration of 5 ng/ml. The quantification of the amatoxins was based on a calibration curve that had been created using dinitrobenzoic acid as an internal standard. The extraction of the analytes was perfomed using SPE columns. Recovery of the amatoxins have increased to 94 % using a dipeptide during the SPE. The method is sufficiently sensitive to determine the amatoxins both in e.g. residues of food and in the urine samples, where the content of the amatoxins is lower. Alfa-amanitine was derivatized with dansyl-chloride in order to increase its response. It was found, however that the derivatization had no significant effect on increasing its response. The method has reached a detection limit of 5 ng/ml for the alfa-amanitine and 10 ng/ml for the beta-amanitine. The limit of quantification was set at 30 ng/ml for the alfa-amanitine and 100 ng/ml for the beta-amanitine.

Keywords

alfa-amanitin, beta-amanitin, LC-MS, muchomůrka zelená, SPE extrakce

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 4. 2015

Accessible from:: 24. 4. 2015

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Petr Fryčák, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry