Functional and structural study of RNA-binding proteins involved in RNA metabolism

Mgr. Veronika Bačíková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

RNA-vázající proteiny se aktivně účastní transcripce a maturace RNA a jsou tak nedílnou součástí živé buňky. Tato práce se zabývá proteiny rozpoznávající RNA a snaží se je představit jako velmi rozmanitou skupinu. Domény rozpoznávající RNA jsou sice relativně malé a jejich typů není mnoho, přesto si osvojily schopnost vázat různé sekvence a struktury RNA molekul. Pomocí přídavných strukturovaných elementů nebo kombinací několika domén současně je umožněno rozpoznávat delší sekvence RNA a dosáhnout tak větší specificity interakce. Tato práce se zaměřuje na kvasinkový protein Nrd1, který obsahuje kromě RNA-rozpoznávajícího motivu také přídatnou doménu se smyčkami a helixy, a díky tomu dokáže vázat různé RNA sekvence. Pro strukturní studium proteinu jsme použili nukleární magnetickou rezonanci a metodou fluorescenční anisotropie jsme charakterizovali vazbu RNA. Význam aminokyselin interagujících s RNA byl potvrzen jak in vitro pomocí fluorescenční anisotropie tak fenotypickou analýzou in vivo. Dálší část práce se zabývá in vitro ligací proteinových fragmentů, tedy metodou, kterou se podařilo v naší laboratoři nově zavést. Nakonec je popsán projekt zaměřující se na PAZ doménu proteinu Argonaut. Na tomto projektu spolupracujeme se skupinou Petra Svobody z Prahy.

Abstract:

RNA-binding proteins (RBPs) are an irreplaceable component of living cell, as they actively participate during RNA transcription and maturation. This work introduces RBPs as a versatile group which adopted several strategies how to recognize many RNA sequential and shape motifs despite limited amount of RNA-binding domain (RBD) types. Structurally, small RBDs can extend RNA-binding surface with additional non-canonical structured elements or they can combine several RBD modules simultaneously to enhance length of recognized RNA and thus specificity of interaction. Here, we study yeast protein Nrd1 which contains an RNA recognition motif (RRM) and a helix-loop bundle domain that can recognize a wide range of RNA sequences. To study the structure and RNA-binding we use nuclear magnetic resonance (NMR) and fluorescence anisotropy (FA). Importance of amino acids critical for RNA recognition was confirmed by FA assay as well as in vivo phenotypic analysis. Next, we established a method of in vitro protein ligation in our lab. Finally, in collaboration with the group of Petr Svoboda from Prague we worked on a project focused on Argonaute PAZ domain.

Keywords

RNA vázající protein, RNA metabolismus, Nrd1 protein, RNA-rozpoznávající motif, ukončení transkripce, nekódující RNA RNA-binding protein, RNA metabolism, RNA-recognition motif, transcription termination, non-coding RNA

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 27. 5. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Lukáš Trantírek, Ph.D., Mgr. Libor Krásný, PhD.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry