Příprava afinitních kolon pro specifickou izolaci proteinů zapojených do virulence patogenů

Mgr. Eva Dudová

Bakalářská práce

Preparation of affinity columns for isolation of proteins involved in virulence of pathogens

Anotace:

Tato práce se zaměřuje na přípravu afinitních kolon pro izolaci glykoproteinů. Na afinitních interakcích je založena řada metod, které jsou využívány v širokém spektru oblastí jako je výzkum, lékařství, hygiena a další. Díky afinitním interakcím jsme schopni separovat, izolovat a specificky detekovat řadu biomolekul. Afinitní interakce vedou k tvorbě stabilních, ale reverzibilních komplexů. Ty jsme schopni následně rozrušit a získat jen potřebné biomolekuly s požadovanými vlastnostmi. Na přípravu afinitních kolon byly použity lektiny BclA a RSL. Oba proteiny byly exprimovány v E.Coli, purifikovány a zkontrolovány pomocí povrchové rezonance plasmonů a izotermální titrační mikrokalorimetrie. Proteiny byly naimobilizovány na komerční sorbent aldehyd-agarosu a pro kontrolu funkčnosti připravených afinitních sorbentů byla použita kontrolní krevní séra Precinorm a LYO HUM, která měla sloužit k otestování připravených afinitních kolon. Bohužel se prokázala nefunkčnost připravených sorbentů a další testy potvrdily, že nedošlo k úspěšnému navázání lektinů na sorbent. Dosažené výsledky však ukázaly, že připravené lektiny vykazují očekávané vazebné schopnosti a mohou být použity jako specifické receptory pro glykoproteiny.

Abstract:

This work is focused on affinity interactions, mainly to involve them in preparation of affinity columns for isolation of glycoproteins. The affinity interactions are fundamentals of many methods, which are employed in numerous fields like research, medicine, hygiene, etc. Utilising affinity interactions we could separate, isolate and specifically detect biomolecules. Affinity interactions lead to stable but reversible complexes. These complexes can be subsequently broken to obtain biomolecules with desired properties. There were used carbohydrate-binding proteins BclA and RSL for production of affinity columns. The proteins were expressed in E.Coli , purified and their binding properties were checked using surface plasmon resonance and isothermal titration microcalorimetry.Both proteins were covalently linked to an aldehyd-agarose resin. Functionality of prepared affinity resins was tested using control blood sera Precinorm and LYO HUM. Results showed that Aldehyd-agarose resin was not functional and further experiments proved that immobilisation of the lectin to the resin was not successful. Anyway the results showed that prepared lectins have desired binding properties and can be employed as specific receptors to catch glycoproteins.

Klíčová slova

lektiny, afinitní interakce, purifikace proteinů, SDS-PAGE, imobilizace proteinů na sorbent, testování sorbentu

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 6. 2008
• Vedoucí: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Nikola Kostlánová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie