Příprava a charakterizace MAP kinázových transgenních linií Medicago sativa

Mgr. Miroslava HRBÁČKOVÁ

Doctoral thesis

Preparation and characterization of MAP kinase transgenic alfalfa lines

Abstract:

Strukoviny sú schopné vytvárať symbiotické interakcie s rhizobaktériami, ktoré sú schopné premieňať atmosférický dusík na amoniak, ktorý je následne asimilovaný hostiteľskou rastlinou. Signalizácia pomocou mitogen-aktivovaných protein kináz (MAPK) môže byť do tejto symbiózy zapojená. MAPK kaskády sú jedny z najviac konzervovaných a najlepšie charakterizovaných proteín kinázových signalizačných dráh. U Lucerny siatej (Medicago sativa L.) bola identifikovaná SIMK ako MAPK indukovaná soľným stresom a elicitormi. SIMKK je nadradeným aktivátorom SIMK a bolo dokázané, že aktivuje SIMK predovšetkým pri soľnom strese. Jedným z hlavných cieľov tejto dizertačnej práce bola príprava a transformácia konštruktov pre fluorescenčne značené SIMK a SIMKK do rastlinných buniek. Boli využité pokročilé mikroskopické metódy na vizualizáciu a imunolokalizáciu SIMK v živých a fixovaných pletivách a bunkách M. sativa. Ďalej bola študovaná nadexpresia SIMK a jej úloha pri raste koreňových vláskov, vytváraní infekčných vlákien, klastrovaní koreňových hľúzok a tvorbe zelenej biomasy. Prvá časť dizertačnej práce je zameraná na plodinu M. sativa. Sumarizuje základné poznatky a popisuje jej biotechnologický potenciál. Táto kapitola sa tiež zaoberá interakciami strukovín s pôdnymi rhizobaktériami a MAPK identifikovanými v M. sativa a v modelovej rastline Arabidopsis thaliana. Nasledujúca kapitola je venovaná príprave a testovaniu fúznych proteínov GFP-SIMK a tagRFP-SIMKK. Expresia fluorescenčne značených SIMK a SIMKK bola overená pomocou tranzientnej transformácie listov Nicotiana benthamiana. Na prípravu nových stabilne transformovaných línií lucerny bol použitý vylepšený a účinný transformačný protokol pomocou Agrobacterium tumefaciens a somatickej embrogenézy. Posledná časť dizertačnej práce je zameraná na charakterizáciu a parametre produkcie u transgénnych línií lucerny s geneticky upravenou SIMK po inokulácii Sinorhizobium meliloti. U transgénnych línií SIMKK RNAi bolo zaznamenané výrazné potlačenie expresie SIMKK a SIMK génov. Tieto línie sa vyznačujú zníženým rastom koreňových vláskov a nižšou schopnosťou tvoriť infekčné vlákna, a následne tiež koreňové hľúzky. Naopak, konštitutívna nadexpresia GFP-značeného SIMK vyvolala u transgénnej línie rast dlhších koreňových vláskov a vytváranie klastrov infekčných vlákien a hľúzok. Zníženie hladiny SIMK a SIMKK transkriptov viedlo k redukcii, zatiaľ čo nadexpresia GFP-SIMK znamenala zvýšenie produkcie zelenej biomasy u stabilne transformovaných rastlín M. sativa. Tieto výsledky poukazujú na to, že génové úpravy SIMK ovplyvňujú rast koreňových vláskov, klastrovanie nodulov a produkciu zelenej biomasy. To poukazuje na významný biotechnologický potenciál tejto proteín kinázy.

Abstract:

Legumes are able to perform symbiotic interactions with rhizobia that are able to convert atmospheric nitrogen into ammonia, which is assimilated by the host plant. Signaling by mitogen-activated protein kinases (MAPKs) seems to be involved in this symbiotic interaction. MAPK cascades are one of the most conserved and best characterized protein kinase signaling pathways. In alfalfa (Medicago sativa L.), SIMK was identified as a salt stress- and elicitor-induced MAPK. SIMKK is an upstream activator of SIMK during alfalfa response to the salt stress. One of the main aims of this Ph.D. thesis was to prepare and transform constructs with fluorescently-tagged SIMK and SIMKK to plant cells. Advanced microscopy techniques were used for live-cell imaging and immunolabeling of SIMK in alfalfa tissues. Next, role of overexpressed SIMK was studied in root hair growth, infection thread formation, nodule clustering and shoot biomass production. The first part of the thesis is devoted to the crop M. sativa. It summarizes the current knowledge on this plant and its biotechnological potential. This chapter of thesis also describes legume-rhizobia interactions and MAPKs identified in alfalfa and model plant Arabidopsis thaliana. The following chapter deals with the cloning and characterization of fusion proteins, GFP-tagged SIMK and tagRFP-tagged SIMKK. Expression of fluorescently-tagged SIMK and SIMKK was checked using transient transformation of Nicotiana benthamiana leaves. New stably transformed alfalfa lines have been prepared by the improved and efficient transformation protocol using Agrobacterium tumefaciens and somatic embryogenesis. The last part of the thesis is dedicated to the characterization of production parameters of transgenic alfalfa plants with genetically engineered SIMK after infection with Sinorhizobium meliloti. SIMKK RNAi lines, showing strong downregulation of both SIMKK and SIMK genes, revealed reduced root hair growth and lower capacity to form infection threads and nodules. In contrast, constitutive overexpression of GFP-tagged SIMK promoted root hair growth as well as infection thread and nodule clustering. Moreover, SIMKK and SIMK downregulation led to decrease, while overexpression of GFP-tagged SIMK promoted shoot biomass production. These data suggest that gene engineering of SIMK expression levels affects root hair, nodule and shoot formation patterns in alfalfa. It highlights new biotechnological potential of this protein kinase.

Keywords

Medicago sativa, Lucerna siata, SIMK, SIMKK, koreňový vlások, Sinorhizobium meliloti, infekčné vlákno, expresia, koreňová hľúzka, CLSM, imunoflourescenčné značenie

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 6. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 17. 9. 2021
• Supervisor: prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc., prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry