Struktura a vybrané funkce chromatinu jako markerů pro klinickou praxi

Mgr. Soňa Legartová, Ph.D.

Doctoral thesis

Structure and selected functions of chromatin as a markers for clinical diagnostics

Abstract:

PhD thesis describes results of three selected papers. The first publication is devoted to the functioning of nuclear lamina. A- and C-type lamins are intermediate filament proteins responsible for the maintenance of nuclear shape and most likely nuclear architecture. In this study, we propose that pronounced invaginations of A/C-type lamins into the nuclear interior represent channels for the transport of regulatory molecules to their targets. Using fluorescent protein technology and immunofluorescence, we showed that A-type lamin channels interact with several nuclear components, including fibrillarin- and UBF-positive regions of nucleoli, foci of heterochromatin proteins HP1β and PcG bodies, or genomic regions associated with DNA repair. Similar associations were observed between A/C-type lamin channels and nuclear pores, lamin-associated protein LAP2α, and PML bodies. These characteristics were observed in primary and immortalized mouse embryonic fibroblasts as well as human and mouse embryonic stem cell colonies exhibiting stem cell-specific lamin positivity. Our findings indicate that internal channels formed by nuclear lamins likely contribute to normal cellular processes through association with various nuclear and nucleolar structures. In the second paper we have analyzed histone signature in apoptotic cells, characterized by pronounced chromatin condensation. We observed that the level of histone H2B mono-acetylation, H3K9 and H4 acetylation was significantly decreased in apoptotic cells and level of H3K9 methylation was maintained high. This epigenetic profile was independent of p53 function. After etoposide pro-apoptotic treatment of leukemia and multiple myeloma cells, H3K9 and H4 hypoacetylation was accompanied by increased H3K9me2, but not H3K9me1 or H3K9me3. In adherent mouse fibroblasts, a high level of H3K9me3 and histone deacetylation in apoptotic bodies was likely responsible for the pronounced (~40%) recovery of GFP-HP1α and GFP-HP1β after photobleaching. HP1 mobility in apoptotic cells appeared to be unique because limited exchange after photobleaching was observed for other epigenetically important proteins, including GFP-JMJD2b histone demethylase (~10% fluorescence recovery) or GFP-BMI1 protein (~20% fluorescence recovery). These findings imply a novel fact that only certain subset of proteins in apoptotic bodies maintains its diffusion abilitities. In the third paper we have studied acetylated forms of histones H2A, H2B, and H4 during induced differentiation in mouse (mESCs) and human (hESCs) embryonic stem cells and during induced enterocytic differentiation of colon cancer cells (HT29) in vitro. Endoderm-like differentiation of mESCs induced by ATRA and enterocytic differentiation induced by NaBt were accompanied by increased mono-, di-, and tri-acetylation of histone H2B and a pronounced increase in di- and tri-acetylation of histone H4. In enterocytes, mono-acetylation of histone H2A also increased and tetra-acetylation of histone H4 appeared only after induction of this differentiation pathway. During differentiation of hESCs, we observed increased mono-acetylation and decreased tri-acetylation of H2B. Mono-, di-, and triacetylation of H4 were reduced, manifested by a significant increase in nonacetylated H4 histones. Levels of acetylated histones increased during induced differentiation in mESCs and during enterocytic differentiation, whereas differentiation of hESCs was associated with reduced acetylation of histones H2B and H4.

Abstract:

Dizertačná práca sa skladá z vybraných publikácii. Prvá publikácia sa venuje problematike jadrovej laminy. Laminy typu A a C sú intermediálne filamenty, ktoré sú zodpovedné za udržovanie celistvosti a tvaru jadra bunky. Na základe získaných výsledkov predpokladáme, že invaginácie laminov typu A/C do vnútorného priestoru jadra slúžia ako kanály na prepravu regulačných molekúl k miestam ich pôsobenia. Pomocou fluorescenčne značených proteínov a imunofluorescencie sme ukázali, že laminové kanály typu A asociujú s proteínmi jadierka ako je fibrilarín, UBF1 a ďalej s ohniskami proteínu HP1β, PcG telieskami a oblasťami genómu podieľajucimi sa na opravách DNA. Podobné asociácie sme zistili aj medzi laminmi typu A/C a pórmi bunkového jadra, proteínmi LAP2α či PML telieskami. Uvedené asociácie boli pozorované nielen v bunkách MEFs a iMEFs ale aj v pluripotentných mES a hES bunkách. Naše zistenia naznačujú, že invaginácie laminov, do priestorov bunkového jadra, sa prostredníctvom asociácii s rôznymi proteínmi podieľajú na bežných procesoch prebiehajúcich v jadre. V druhom článku bol skúmaný histónový kód v bunkách podliehajúcich apoptóze, pre ktoré je charakteristická vysoká kondenzácia chromatínu. Zistili sme, že bunky v apoptóze mali charakteristicky nízke hladiny monoacetylácie histónov H2B, H3 v pozícii lyzínu 9 (K9) a H4 acetylácie a vysokú hladinu H3K9 metylácie. Tento fenotyp bol nezávislý na funkčnosti proteínu p53. Po pridaní pro-apoptotického činidla etopozidu, dochádzalo v leukemických aj v myelomových bunkách k hypoacetylácii histónov H3K9 a H4, čo bolo sprevádzané nárastom hladiny H3K9me2, ale množstvá H3K9me1 a H3K9me3 zostali nezmenené. V adherentných bunkách iMEFs vysoká hladina H3K9me3 spojená s deacetyláciou v apoptotických telieskach ovplyvňovala schopnosť difúzie proteínov do oblasti po fotovybielení. Dochádzalo k výraznému zníženiu relatívnej fluorescencie u histónovej demetylázy JMJD2b (~10 %) a proteínu BMI1 (~20 %). Naproti tomu u proteínov heterochromatínu HP1α a HP1β, dochádzalo v apoptotických bunkách k obnoveniu fluorescencie približne na 40 % pôvodnej hodnoty. Tieto zistenia môžu znamenať novú skutočnosť a to, že iba určitá frakcia proteínov v apoptotických telieskach si zachováva schopnosť difúzie. V tretej publikácii sme sa zamerali na acetylované formy histónov H2A, H2B a H4 v priebehu diferenciácie mES, hES a HT29 buniek. Diferenciácia mESCs do endodermu bola indukovaná pomocou ATRA a diferenciácia buniek HT29 do enterocytov bola indukovaná NaBt. V uvedených bunkových líniach dochádzalo k nárastu mono-, di- a triacetylácie histónov H2B spoločne s di- a triacetyláciou H4. V enterocytoch tiež dochádzalo k nárastu monoacetylácie histónov H2A a jedine v tejto diferenciačnej dráhe sa objavila dokonca aj tetraacetylácia histónu H4. V priebehu diferenciácie hESCs dochádzalo k zvýšeniu hladiny monoacetylácie a zároveň k zníženiu triacetylácie H2B. Mono-, di- a triacetylácie H4 boli tiež znížené, dôsledkom čoho dochádzalo k nárastu hladiny neacetylovaných histónov H4. Pri použití inhibítorov histónových deacetyláz (HDAC) po indukcii diferenciácie dochádzalo k výraznému zvýšeniu acetylovaných foriem histónov. Naproti tomu pre diferenciované hESCs boli charakteristické znížené hladiny acetylácie histónov H2B a H4.

Keywords

históny, epigenetika, chromatín, transkripcia, oprava DNA, acetylácia, laminy, jadrové póry, proteín HP1, ES bunky, apoptóza, MALDI-TOF histones, epigenetics, transcription, DNA repair, acetylation, lamins, nuclear pores, HP1 protein, ES cells, apoptosis, MALDI-TOF

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 7. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 4. 9. 2014
• Supervisor: doc. RNDr. Stanislav Kozubek, DrSc.
• Reader: RNDr. Aleš Kovařík, CSc., doc. RNDr. Irena Krontorád Koutná, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology