Embryonální vývoj neoplozených vajíček bource morušového

Bc. Markéta VRCHOTOVÁ

Master's thesis

Embryonic development of the unfertilized silkworm eggs

Abstract:

Transgenoze je nástroj, kterým lze dále vylepšovat vlastnosti hedvábí produkovaného bourcem morušovým nebo který umožní použít bource jako producenta rekombinantních proteinů využitelných v lékařství. Zabelina et al. (2015a) vytvořili transgenní partenogenetickou linii, jejíž výhodou bylo rychlé získání homozygotů ve vloženém transgenu se stabilní expresí v dalších generacích. Účinnost vlastní transgenoze však byla nižší než 2 %, zatímco u běžných nepartenogenetických linií se pohybuje v rozmezí 20 - 60 %. Náplní mé práce bylo hledání příčin tohoto rozdílu. Protože úspěch transgenoze závisí na injekci do vajíček před dokončením tvorby blastodermu, zdálo se, že nebyla použita vajíčka vhodného stupně vývoje. Transgenoze se u standardních linií provádí při teplotě 25 °C, zatímco vajíčka partenogenetických linií je třeba po aktivaci tepelným šokem inkubovat 3 dny v 15 °C. Překážkou pro transgenozi partenogenetických linií je rovněž embryonální diapauza. K jejímu potlačení při tvorbě transgenní partenogenetické linie VTG1 byla použita transplantace vaječníků partenogenetické linie do samčích housenek standardní linie. V práci byla porovnávána vajíčka standardní a partenogenetické linie vyvíjející se v 15 °C. Vliv teploty na vývoj byl pozorován u standardní linie K23 inkubované v teplotách 25 a 15 °C. Embryogeneze byla v 25 °C asi dvakrát rychlejší než v 15 °C. U implantátů ze samců a ze samic nebyl pozorován rozdíl v rychlosti vývoje. S ohledem na průběh rýhování je možno doporučit k injekci konstruktem DNA čas 24 h po aktivaci partenogeneze. Vývoj partenogenetické linie bez zásahu v porovnání s implantáty byl srovnatelný. Vývoj u standardní linie probíhal rychleji než při aktivaci embryogeneze tepelným šokem. Vlastní vajíčka samic K23 vyvíjející se v přítomnosti implantátu získala částečnou schopnost partenogeneze. Vývoj transgenní partenogenetické linie VTG1 byl pomalejší než vývoj partenogenetické linie PK1. Je zřejmé, že interpretace a využití rozdílů v rychlosti embryogeneze bource vyžaduje další výzkum.

Abstract:

Transgenesis of silkworms has great potential for the development of silk with new properties as well as for the preparation of recombinant proteins for the use in biomedicine. Zabelina et al. (2015a) showed that transgenesis of parthenogenetic silkworms facilitates the selection and maintenance of transgenic homozygotes with stabile transgene insertions. However, the efficiency of transgenesis was less than 2 % compared to 60 % in the standard, non-parthenogenetic silkworms. The purpose of the present research was to explore the cause of this difference. Since transgenesis is normally performed at 25 °C but in the parthenogenetic silkworms at 15 °C (3 days incubation at this temperature is part of the protocol for the induction of parthenogenetic development), we assumed that the eggs incubated at 15 °C might have been injected with the DNA construct at unsuitable time. The work was therefore focused on the rate of embryogenesis at 15 °C in the eggs treated in different ways. Intensive cleavage of the control eggs (strain K23) was observed at 12 h after oviposition at 25 °C and between 24 and 36 h at 15 °C. The transgenesis of parthenogenetic silkworms is also complicated by the embryonic diapause. In the current work, diapause was suppressed by implanting PK1 ovaries into the non-parthenogenetic male hosts K23. Parthenogenetic development was activated by the heat shock in the chorionated eggs dissected from the implants. No cleavage was detected at 12 h after the acti-vation and nearly complete blastoderm was found at 48 h. In respect to the course of cleavage at 15 °C, transgene injection 24 h after the activating heat shock can be recommended. The eggs from endogenous ovaries of the K23 females, which also contained the implants of the PK1 ovaries, acquired partial capacity of parthenogenesis. Low rate of embryogenesis was also found in the transgenic clone VTG1. Current results suggest that more research is needed to understand and possibly explore differences in the rate of silkworms exposed to different treatments.

Keywords

Bombyx mori, embryogeneze, partenogeneze, transgenoze, transplantace ovarií, embryonální diapauza

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. František Sehnal, CSc.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Agriculture

Master programme / field:
Agriculture Specialization / Biology and protection of "hobby" organisms