Nízkomolekulární inhibitory signálních drah a možnosti jejich využití v kombinované terapii solidních nádorů dětského věku

Mgr. Mária Krchniaková, Ph.D.

Doctoral thesis

Low-molecular-weight inhibitors of signaling pathways and their potential use in combined therapy of solid tumors in children

Abstract:

V dětské onkologii i přes zvýšenou dostupnost moderních možností personalizované léčby zůstává prognóza zvláště u pacientů s nádory vysokého rizika nepříznivá. Pro překonání této situace jsou využívány i strategie, které kombinují různé typy protinádorových léčiv, což může znamenat nižší toxicitu a současně ovlivnění více cílů v nádorových buňkách samotných i v nádorovém mikroprostředí. Tato disertační práce je zaměřena na objasnění mechanismů synergie vybraných léčiv v buněčných liniích derivovaných z nejčastějších typů solidních nádorů dětského věku. Naše předchozí studie prokázaly, že kombinace chelatačních činidel ze skupiny nových thiosemicarbazonů s konvenčními cytotoxickými léčivy, která jsou standardně využívána u dětských malignit, vede k synergickým efektům. Na základě těchto slibných výsledků jsme se zaměřili na kombinování thiosemicarbazonů s cílenými léčivy – tyrosinkinázovými inhibitory (TKI), konkrétně se sunitinibem, gefitinibem a lapatinibem. Již dříve bylo prokázáno, že thiosemicarbazony jsou schopné obnovit citlivost karcinomových buněk vůči doxorubicinu mechanismem jeho uvolnění z lysozomů. Uvedené tři TKI proto byly vybrány jednak na základě svých lysozomotropních vlastností, a dále kvůli dříve již popsanému mechanismu rezistence nádorových buněk vůči nim právě pomocí jejich sekvestrace do lysozomů. Naše pilotní výsledky však ukázaly, že protinádorová aktivita thiosemicarbazonů u buněk derivovaných ze solidních nádorů dětského věku není s největší pravděpodobností založena na prasknutí lysozomu a uvolnění léčiva do cytoplazmy. Jako nejúčinnější byl překvapivě identifikován zcela odlišný design kombinování uvedených léčiv. Tento design umožnil použití nižších koncentrací jednotlivých léčiv, zejména thiosemicarbazonů pro dosažení srovnatelného biologického účinku. Detailní analýza sledovaných interakcí u buněk neuroblastomu pak ukázala, že TKI a thiosemicarbazony společně narušují onkogenní signální dráhy. Zatímco TKI inhibovaly aktivaci odpovídajících receptorových tyrosinkináz, thiosemicarbazony snížily expresi zejména receptorů pro některé růstové faktory, konkrétně pro EGFR, PDGFRβ a IGF-1R, což následně vedlo k indukci apoptózy. Zároveň bylo detekováno významné zvýšení hladiny supresoru metastázování NDRG1 (N-MYC downstream regulated gene-1) v neuroblastomových buňkách ovlivněných thiosemicarbazony. Tyto efekty byly ještě výraznější po ovlivnění buněk kombinací obou typů léčiv, zejména po zkombinování thiosemicarbazonů s lapatinibem. Zároveň bylo zjištěno, že snížení exprese EGFR je způsobeno právě aktivitou proteinu NDRG1. Tyto zjištěné synergické interakce mezi vybranými TKI a chelatory železa tak poskytují východisko pro hledání nových terapeutických přístupů založených na kombinované terapii.

Abstract:

Despite the increasing availability of modern and personalized therapeutic modalities in pediatric oncology, the outcome of particularly high-risk patients remains unfavorable. To overcome these obstacles, strategies that combine more types of anticancer drugs together present a less toxic approach that enables modulation of multiple targets within cancer cells and the tumor microenvironment. This thesis is focused on the elucidation of synergy mechanisms of selected therapeutics in cell lines derived from the most frequent pediatric solid tumors. Our previous studies demonstrated synergistic effects between novel thiosemicarbazones and conventional cytotoxic drugs routinely used to treat pediatric malignancies. Based on these promising data, we evaluated the interactions between the iron-chelating thiosemicarbazones and targeted therapeutics – tyrosine kinase inhibitors (TKIs), namely, sunitinib, gefitinib and lapatinib. Thiosemicarbazones were shown to restore the sensitivity of carcinoma cells by releasing doxorubicin from lysosomes. Therefore, the abovementioned TKIs were selected for their lysosomotropic characteristics and a well-described mechanism of resistance through lysosomal trapping. However, our initial results indicated that the anticancer activity of thiosemicarbazones in pediatric solid tumor cells is most likely not mediated through lysosomal burst. Surprisingly, a different combination design was demonstrated to be the most effective. Furthermore, this new design allowed the use of much lower drug concentrations, specifically thiosemicarbazones. A detailed molecular analysis in neuroblastoma cells showed that TKIs and thiosemicarbazones converged on impaired pro-oncogenic signaling. While TKIs inhibited the activation of corresponding receptor tyrosine kinases, thiosemicarbazones downregulated the expression of EGFR, PDGFRβ and IGF-1R, leading to a strong induction of apoptosis. Additionally, a significant upregulation of the metastasis suppressor NDRG1 (N-MYC downstream regulated gene-1) was detected in thiosemicarbazone-treated neuroblastoma cells. These effects were more pronounced in cells treated with drug combinations, especially when thiosemicarbazones were combined with lapatinib. Furthermore, the downregulation of EGFR was attributed to NDRG1 activity. Overall, the demonstrated synergistic interactions provide a rationale for novel approaches combining TKIs with iron-chelating agents in the therapy of pediatric solid tumors.

Keywords

solidní nádory dětského věku, neuroblastom, meduloblastom, osteosarkom, rhabdomyosarkom, kombinovaná terapie, tyrosinkinázové inhibitory, sunitinib, gefitinib, lapatinib, thiosemicarbazony, synergie, receptorové tyrosinkinázy, NDRG1, pediatric solid tumors, neuroblastoma, medulloblastoma, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, combined therapy, tyrosine kinase inhibitors, thiosemicarbazones, synergy, receptor tyrosine kinases

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 9. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 4. 11. 2022
• Supervisor: prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D.
• Reader: prof. PharmDr. Emil Rudolf, Ph.D., prof. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Molecular and Cell Biology and Genetics / Molecular and Cell Biology and Genetics