Úloha regulace translace specifických mRNA a fosforylačně=defosforylačních mechanismů během meiotického zrání savčích oocytů a časného embryonálního vývoje.

Ing. Ing. Barbora Procházková

Doctoral thesis

The role of regulation translation specific mRNA and phosporylation-anphosporylation mechanisms during meiotic maturation of mammalian oocyte and embryonic development.

Abstract:

Meotické zrání oocytů a embryogeneze patří k nejdůležitějším fyziologickým procesům, které hrají zásadní roli v zachování všech živočišných druhů. V průběhu zrání oocytů je potlačena transkripce a exprese genů je tak řízena na úrovni translace. Pro správný průběh a kontrolu zrání oocytů a časnou embryogenezi jsou rozhodující posttranskripční regulace mateřských mRNA a posttranslační regulace proteinů. Translační kontrola ovlivňuje základní mechanismus syntézy bílkovin a pro pochopení její regulace je nutná znalost všech klíčových komponent, které jsou součástí tohoto mechanismu. Translace maternálních mRNA se odvíjí od jejich časově specifické cytoplazmatické polyadenylace a od jejich interakce s RNA-vazebnými proteiny, zejména pak s proteiny z rodiny CPEB. Cytoplazmatické polyadenylační elementy vázající proteiny (CPEB) se váží na 3'-konec mRNA a regulují její lokalizaci a translaci a jsou tak nezbytné pro správný vývoj.Průběh meiotického zrání je však řízen celou kaskádou regulačních molekul a komplexů. Důležitými regulačními proteiny meiotického zrání jsou také členové Emi/Erp rodiny – proteiny Emi1 a Emi2. Jejich hlavní úlohou je regulace meiotického (ale i mitotického) dělení přímou inhibicí APC/C (anaphase promoting komplex/cyclosome), který má za úkol spouštění rozestupu chromosomů do dceřiných buněk. Emi1 i Emi2 jsou důležitou součástí CSF (cytostatic factor), který má za úkol stabilizaci a udržení MPF (metaphase promoting factor), během anafáze II, která je nezbytná pro zastavení meiózy a vytvoření meiotického bloku.Cílem mé disertační práce bylo zmapovat a porovnat expresi a aktivitu Emi1 a Emi2 proteinů a regulaci jejich genové exprese, která významně ovlivňuje správný průběh meiózy i mitoźy. Dále bylo cílem práce doplnit chybějící informace o CPEB proteinech a zmapovat jejich expresi, fosforylaci a funkci v reprodukci savců. Zejména jsme se zaměřili na protein CPEB2, jehož funkce během těchto procesů nebyla doposud dobře zmapována. Cílem práce bylo také testování nových makrocyklických inhibiotrů Emi2 na bázi pyrrolů, které byly vivinuty ve spolupráci s Dr. Bangem, Dr. Gunasekaranem a dalšími z KBSI (Korea Basic Science Institute).Výsledky naší práce byla potvrzena hypotéza, že se exprese Emi1 a Emi2 proteinů liší mezi jednotlivými fázemi meiotického zrání myších a prasečích oocytů a že exprese Emi1 a Emi2 proteinů je v přímé korelaci s polyadenylací 3' konce jejich mRNA. Zásadními posttranskripčními úpravami, jež u nich regulují genovou expresi, je tedy právě polyadenylace.Byly rovněž potvrzeny hypotézy, že exprese Emi1 proteinu přetrvává i po fertilizaci či parthenogenetické aktivaci oocytů a že proteinu Emi2 je po fertilizaci či parthengenetické aktivaci oocytů degradován a k jeho reakumulaci dochází až během prvních cyklů mitózy. Zároveň bylo ověřeno, že zablokování Polo-box domény Plk1 malými makrocyklickými inhibiotry zabrání fosforylaci Emi2 a sníží tak procento myších a prasečích oocytů maturovaných do MII fáze.Co se týče výzkumu cytoplazmatické polyadenylační elementy vázajících proteinů, byla ověřena hypotéza, že se exprese CPEB2 mRNA i proteinu liší v jednotlivých fázích meiotického zrání prasečích oocytů a stádií ranných parthenogenetických embryí a je pro jejich zdárný vývoj nezbytná. Také byla ověřena hypotéza, že i v prasečích oocytech jsou dvě formy CPEB2 transkriptu – CPEB2A a CPEB2B. Nicméně hypotéza, že se po zablokování CPEB2 zvýší exprese ostatních cytoplazmatické polyadenylační elementy vázajících proteinů z CPEB2 subrodiny (CPEB3, CPEB4) a částečně tedy nahradí jeho funkci, byla vyvrácena, i když bylo potvrzeno, že CPEB3 a CPEB4 transkripty jsou

Abstract:

přítomny ve všech fázích meiotického zrání. Rovněž náš výzkum potvrdil hypotézu, že jediným členem CPEB2 subrodiny, jehož inhibice nemá letální vliv na meiotické zrání myších oocytů, je CPEB4 a potvrdili jsme tak již dříve diskutovanou možnost, že je jeho funkce u deficientních buněk nahrazena jiným mechanismem, což bude otázkou budoucího výzkumu.Výsledky této práce pomohly objasnit jeden z klíčových procesů významně ovlivňujících správný průběh meiózy a molekulární mechanismy ovlivňující výstup oocytů z MII bloku a bezchybné zahájení embryonálního vývoje. Naše poznatky mohou rovněž přispět ke zlepšení podmínek in vitro kultivace oocytů a potažmo in vitro produkce embryí u savců.

Abstract:

Oocyte meiotic maturation and embryogenesis belong to the most important physiological processes, which play a crucial role for the preservation of life in all species. Oocytes undergoing meiotic maturation are transcriptionally silent and gene expression is therefore regulated at the level of translation. The post-transcriptional regulation of maternal mRNAs and post-translational regulation of proteins are critical to control oocyte maturation and early embryogenesis. Translational control affects the basic mechanism of protein synthesis and the knowledge of the key components, which are included in this machinery, is necessary for understanding its regulation. Cytoplasmic polyadenylation element binding proteins (CPEBs) bind to 3'-end of mRNAs to regulate their localization and translation and are necessary for proper development.However, a whole cascade of regulatory molecules and complexes controls the progression of meiotic maturation. Important regulatory proteins of meiotic maturation are also two members of Emi/Erp family – proteins Emi1 and Emi2. Their main role is the regulation of meiotic (and mitotic) division by direct inhibition of APC/C (anaphase Promoting Complex/cyclosome). APC/C is responsible for triggering separation of chromosomes into the daughter cells. Emi1 and Emi2 are important parts of CSF (cytostatic factor), their task is to stabilize and maintain MPF (Metaphase Promoting Factor) during anaphase II, which is essential for stopping meiosis and for the establishment of meiotic block.The aim of my dissertation was to map and compare the expression and activity of Emi1 and Emi2 proteins and explain the mechanism of their gene expression regulation, which significantly influences the correct course of meiosis and mitoses. Furthermore, the aim of the work was to supplement missing information about CPEB proteins and to map out their expression, phosphorylation and function in mammalian reproduction. We especially focused on CPEB2 protein, whose function has not been well mapped during these processes. The aim of the work was also to test the new pyrrole-based macrocyclic inhibitors of Emi2, which were created in collaboration with Dr. Bangem, Dr. Gunasekaran and others from the Korea Basic Science Institute (KBSI).The results of our work confirmed the hypothesis that the expression of Emi1 and Emi2 proteins differ between the phases of meiotic maturation of mouse and pig oocytes and that the expression of Emi1 and Emi2 proteins are in direct correlation with polyadenylation of 3' end of their mRNA. The fundamental post-transcriptional modifications that regulate gene expression are polyadenylation. Also has been confirmed the hypothesis that expression of Emi1 protein persists even after fertilization or parthenogenetic activation of oocytes, and that Emi2 protein is degraded after fertilization or parthenogenetic oocyte activation and his reactivation occurs during the first cycles of mitosis. At the same time, it was verified that blocking the Polo-box domain of Plk1 with small macrocyclic inhibitors prevents the phosphorylation of Emi2 and thus reduce the percentage of mouse and pig oocytes mature in the MII phase.Regarding the research of CPEBs, the hypothesis, that expression of CPEB2 mRNA and protein differs in the phases of meiotic maturation of pig oocytes and stage of early parthenogenetic embryos and is necessary for their successful development, was verified. The hypothesis that in porcine oocytes are also two forms of CPEB2 transcripts - CPEB2A and CPEB2B was also confirmed. However, the hypothesis that CPEB2 inhibition will increase the expression of other cytoplasmic polyadenylation element binding proteins from CPEB2 subfamily (CPEB3, CPEB4) and partially replace its function was refuted, although it was confirmed that CPEB3 and CPEB4 transcripts are present in all phases of the meiotic maturation. Also was confirmed that only member of the CPEB2 subfamily whose inhibition does not hav

Abstract:

e a lethal effect on the meiotic maturation of mouse oocytes is CPEB4. Confirming the previously discussed possibility that its function in deficient cells is replaced by another mechanism, which will be a question of future research.The results of this work helped clarify one of the key processes significantly influencing the correct course of meiosis and the molecular mechanisms affecting the output of oocytes from the MII block and the flawless embryonic development. Our findings can also contribute to improving the conditions of in vitro oocyte culture and, consequently, in vitro mammalian embryo production.

Keywords

meiotické zrání, oocyt, raná embryogeneze, polyadenylace mRNA, translace, Emi1, Emi2, inhibitory Emi2, CPEB2, CPEB3, CPEB4

Keywords

meiotic maturation, oocyte, early embryogenesis, mRNA polyadenylation, translation, Emi1, Emi2, inhibitors of Emi2, CPEB2, CPEB3, CPEB4

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 9. 2018

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Animal Science / General Animal Science