Vývoj instrumentace a metodiky analýz biologicky významných látek v jednotlivých buňkách

Mgr. Michael Killinger, DiS.

Doctoral thesis

Development of the instrumentation and methodology for single-cell analysis

Abstract:

V této práci jsme optimalizovali přístrojové vybavení a metodologii pro spolehlivé hodnocení absolutního množství aktivních kaspáz-3/7 a jejich variabilitu v jednotlivých buňkách za různých podmínek. Zaměřili jsme se množství kaspáz-3/7 během proliferace, diferenciace a buněčné smrti pre-osteoblastických buněk MC3T3-E1. Dále bylo toho zařízení využito k potvrzení klíčové role kaspázy-8 během osteogeneze. Kromě toho jsme vyvinuli platformu s mikrojamkami z polydimethylsiloxanu (PDMS) vhodnou pro kultivaci 3D buněk. Precizní výroba a příprava vedly k vytvoření homogenních 3D buněčných kultur vhodných pro další testování. Navíc jsme vytvořili miniaturizovanou kultivační komoru a několik mikrofluidních PDMS platforem, které lze přizpůsobit konkrétním vlastnostem buněk a tkáňové architektuře. Systém byl úspěšně použit k testování a hodnocení dynamického prostředí na osteogenní diferenciaci 3D buněčných kultur z lidských primárních osteoblastů.

Abstract:

In this work, we optimized instrumentation and methodology for reliable evaluation of the absolute amount of active caspase-3/7 and their variability in single-cells under various conditions. We have investigated the amounts of caspase-3/7 during cell proliferation, differentiation, and cell death of MC3T3-E1 pre-osteoblast cells. This device was utilized to confirm the crucial function of caspase-8 during osteogenesis. Moreover, we also developed a polydimethylsiloxane (PDMS) microwell platform suitable for 3D cell cultivation. The proper fabrication and preparation led to the development of homogenous 3D cell cultures suitable for other testing. In addition, we have created a miniature cultivation chamber and multiple PDMS microfluidic platforms that can be tailored to suit particular cell properties and tissue architecture. The system was successfully used for testing and evaluating the dynamic flow environment for an osteogenic differentiation process using 3D primary human osteoblast cell cultures.

Keywords

Single-cell Analysis, Miniaturization, Bone, 3D Cell Cultures, Microfluidics, Organs on a Chip

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 12. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 16. 2. 2024
• Supervisor: Ing. Karel Klepárník, CSc.
• Reader: Mgr. Petra Jusková, Ph.D., prof. RNDr. Monika Pávková Goldbergová, Ph.D., doc. Eric Daniel Glowacki, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry