Vliv lyzogenie na evoluci a dynamiku virulentních klonů Staphylococus aureus

Mgr. Jana Rájová, Ph.D.

Disertační práce

The impact of lysogeny on the evolution and dynamics of Staphylococcus aureus virulent clones

Anotace:

Druh Staphylococcus aureus je významný humánní a veterinární patogen způsobující lokální a systémové infekce. Patogenita druhu S. aureus závisí na produkci virulentních faktorů a obsahu determinant rezistence k běžně užívaným antimikrobiálním látkám. Faktory virulence jsou často kódovány mobilními genetickými elementy – např. profágy, na které se zaměřuje tato práce. V práci byla vyvinuta metoda pro extrakci fágové DNA z minimálního objemu (100 l) fágových lyzátu. Bylo vyzkoušeno několik typů nosičů využívaných pro extrakci DNA z biologického materiálu, konkrétně komerčně dostupné QIAEX II a NucleoMag96Blood i experimentálně používané magnetické nosiče P-(HEMA-co-EDMA). Pro další postup byla použita sada QIAEX II. Komparativní analýza sekvencí umožnila stanovit úseky genomových modulů, které jsou vhodné pro typizaci prostřednictvím PCR. Na základě těchto sekvencí bylo nově navrženo pět multiplex, dvě jednoduché PCR-reakce a aktualizovány dvě dříve navržené reakce. Tento soubor umožnil jednoznačnou charakterizaci a diferenciaci většiny testovaných fágů a profágů S. aureus. Multilokusová PCR-typizace byla aplikována také na soubor fágů nesoucích geny pro Pantonův-Valentinův leukocidin (PVL) indukovaných z klinických izolátů. Byl charakterizován soubor českých klinicky významných PVL pozitivních izolátů druhu S. aureus, pocházející z terénních mikrobiologických laboratoří. Převážná část byla izolována z kožních infekcí; devět kmenů bylo původcem nekrotizující pneumonie. Mezi komunitními kmeny v ČR dominovala vysoce virulentní linie USA300. Byly zachyceny také nově vznikající kmeny, které v současnosti akumulují faktory virulence a představují potenciální nové virulentní klony. Nejvíce pozornosti bylo věnováno charakterizaci PVL konvertujících fágů z klinických izolátů. Celkem bylo získáno 9 fágů indukovaných z kmenů izolovaných v ČR. Dále byly indukovány PVL pozitivní fágy z referenčních kmenů MW2, ST398 a V8. Tyto fágy bylo možné rozdělit do čtyř odlišných skupin, z nichž pouze jedna označená Sa2usa byla popsána mezi doposud známými PVL fágy či profágy v databázi nukleotidových sekvencí. Přes určité vazby genomových modulů charakteristické pro PVL pozitivní fágy, jako je typ integráza-amidáza, eventuálně přítomnost jednoho ze dvou charakteristických typů strukturních modulů A nebo F, je pravděpodobně možná jakákoli kombinace dalších genomových modulů a lze očekávat popis dalších odlišných variant fágů. Rozdíly mezi fágy se dotýkaly převážně raně a středně exprimovaných genů, ale v případě Sa2intFa fágů došlo ke změně v oblasti pozdně exprimovaných genů zodpovědných za vlastnosti kapsidu. Lytické vlastnosti fágů korelovaly s jejich strukturním typem. Pouze skupina Sa2intFb byla vázaná na kmeny jedné linie, ostatní se nacházely v rámci různých nepříbuzných linií. Metodiky navržené v této práci umožňují studovat evoluci fágů přenášejících geny pro klinicky významný toxin PVL a spolu se znalostí epidemiologických údajů dovolují eventuálně navrhnout kroky bránící jejich dalšímu šíření.

Abstract:

Staphylococcus aureus is an important opportunistic human and veterinary pathogen with the capability of causing a wide range of local and systemic infection or food poisoning. Much of the dissimilarity between pathogenic S. aureus strains is dependent on the presence of virulence factors encoded mainly by mobile genetic elements, e.g. bacteriophages. Phages are important mediators of horizontal gene transfer of different virulence factors such as Panton-Valentine leukocidin. A quick method for phage PCR-ready DNA extraction from small volumes (100 μl) of S. aureus phage lysates was developed. We have tested three types of carriers; commercial particles for DNA extraction from biological samples QIAEX II and MucleoMag96Blood or experimental carboxyl-functionalized nonporous magnetic microspheres P(HEMA-co-EDMA). The QIAEX II kit was chosen. Comparative genomic analysis of complete phage or prophage genomes currently available in the databases allowed the identification of conserved sequences suitable for PCR typization and covering all known genome modules. The nine PCR assays designed for the above sequences were shown to be capable to identify the bacteriophage gene pool present both in the phage and bacterial genomes and their extensive mosaic structure. The above described method was applied on a set of nine PVL-positive phages induced from clinical S. aureus strains. We characterized a set of PVL-positive S. aureus isolates from hospital microbiology departments of the Czech Republic in 2004-2011. Strains were associated mainly with skin and soft tissue infections, but also with necrotising pneumonia. The most frequent was the highly virulent USA300 lineage. We identified also several strains accumulating virulence genes and constituting future virulent clones. The focus was on characterisation of PVL converting phages isolated from clinical isolates of S. aureus. We obtained nine PVL positive phages induced from Czech community strains and phages from reference strains MW2, ST398 and V8. We identified four phage types: one group identical to Sa2usa, two phage strains with new combination of early- and middle-expressed module types and phage strain representing a novel type of still undescribed PVL-converting phage harbouring morphogenesis module type Fa and non-typeable transcription regulation module. Despite of links between some genomic modules characteristic for PVL genes (Sa2int and ami2) or structure modules (A or F), the genomic modules found in one phage can be independently replaced in another phage by a sequence-unrelated module. Therefore, we are expecting new phage strain identification. Lytic properties of phages correlate with capsid type. The Sa2intFb group was the only one that was linked to one lineage; the others were found in distinct unrelated clones. The established multiplex PCR based multilocus diagnostic scheme is convenient for rapid and reliable phage and prophage classification and for the study of bacteriophage evolution. Both, understanding of fitness and epidemiology of resistant clones and epidemiological data enable a proposition of strategies preventing further PVL spreading.

Klíčová slova

Staphylococcus aureus, bakteriofág, Pantonův-Valentinův leukocidin Staphylococcus aureus, bakteriophage, Panton-Valentine leukocidin

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 17. 6. 2011
• Vedoucí: doc. RNDr. Roman Pantůček, Ph.D.
• Oponent: prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D., doc. RNDr. Hana Drahovská, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie