Detekce a kvantifikace UV - absorbujících látek a fotosyntetických pigmentů u vyšších rostlin

Mgr. Jakub NEZVAL

Master's thesis

The Detection and Quantification of UV - absorbing Substances and Photosynthetic Pigments of Higher Plants

Abstract:

Fotosyntetické pigmenty a fenolické látky se řadí mezi velice významné rostlinné biomolekuly. Zastávají v rostlinách pestrou škálu funkcí. Mimo jiné se tyto látky významně podílí i na fotoprotektivních mechanismech (UV-stínění, xantofylový cyklus, atd.). Hlavním cílem této práce bylo zavedení metodik umožňujících identifikaci a kvantifikaci fenolických látek. Dalším cílem pak jejich aplikace při pozorování změn obsahu fenolických látek a fotosyntetických pigmentů v rostlinách indukovaných UV radiací (UVR). K zavedení metodik pro identifikaci a kvantifikaci fenolických látek byly použity metanolové roztoky standardů. Absorpční spektra byla změřena spektrofotometricky v rozsahu 200-750 nm a byly popsány jejich charakteristické prvky (absorpční maxima, ramena absorpčních pásů). HPLC metodika pro separaci a kvantifikaci fenolických látek uvedená v Kolb & Pfündel (2005) byla rozšířena o detekci na dalších třech vlnových délkách (220, 240 a 440 nm) ? absorpční spektra byla zaznamenána v rozsahu 220-500 nm. Analýzou koncentračních řad 11 standardů byla získána absorpční spektra, retenční časy a relativní plochy píků, nezbytné k sestavení kalibračních rovnic umožňujících kvantifikaci těchto látek oběma výše zmíněnými metodami. Díky modifikaci HPLC metodiky bylo možné detekovat a kvantifikovat všechny použité standardy fenolických látek. Pro pěstování rostlin při zvýšené hladině UVR byly zkonstruovány dvě osvětlovací aparatury, využívající dvou odlišných zdrojů světla ? zářivky (Repti Light) a světlo emitujících diod (LED). Identifikace a kvantifikace fotosyntetických pigmentů resp. fenolických látek byla provedena v acetonových (80 %, v/v) resp. metanolových (40 %, v/v) extraktech primárních listů ječmene jarního (Hordeum vulgare L. cv. Bonus). V důsledku působení UVR byl pozorován mírný pokles obsahu chlorofylů A a B, pokles poměru Chl A/ Chl B, nárůst deepoxidačních poměrů (DEPS) a nárůst obsahu zeaxantinu. Výsledky svědčí o degradaci složek fotosyntetického aparátu a aktivaci fotoprotektivních mechanismů vlivem UVR. V metanolových extraktech UVR přisvětlovaných rostlin byl pozorován větší obsah UV absorbujících fenolických látek. Bylo detekováno 7 těchto látek (deriváty fenolických kyselin, derivát luteolin, deriváty apigeninu), přičemž hlavní UV absorbující složkou je s největší pravděpodobností saponarin.

Abstract:

The Photosynthetic pigments and phenolic compounds are very important biomolecules. Both of them have many various physiological functions in plants. They are known i.a. as plant photoprotectors ? they play an important role in UV-shielding and xanthophyll cycle. The main objective of this work was to set up methods for identification and quantification of phenolic compounds. The another objective was to apply these methods in observations of phenolics and photosynthetic pigments alterations induced in plant material by UV radiation (UVR). In order to establish new methods for identification and quantification of phenolic compounds, 11 standards (dissolved in pure methanol) were used. Absorption spectra were measured using the UV-VIS absorption spectrophotometer in the spectral range of 200-700 nm. Spectral characteristics were recorded (absorption maxima, absorption band shoulders). HPLC method for phenolic compounds separation and quantification published by Kolb & Pfündel (2005) was enhanced with detection at another three wavelengths (220, 240 and 440 nm) ? absorption spectra were recorded in spectral region of 220 -500 nm. By analyses of standards solutions of known concentrations, absorption spectra, retention times and relative peak areas were obtained. On the basis of these data new calibration equations were established. These equations can be used for quantification of all 11 standards by both methods. For the UVR treatment experiment two special light devices equipped with two different light sources (fluorescent lamp, LED) were designed. For identification and quantification of photosynthetic pigments and phenolic compounds in plant material, acetone (80 %, v/v) and methanol (40 %, v/v) extracts of barley primary leaves (Hordeum vulgare L. cv. Bonus) were used respectively. In UVR treated samples lower chlorophyll A and B content, lower Chl A / Chl B ratio, increased deepoxidation ratios (DEPSs) and increased content of zeaxantin were observed. These results show evidence of the negative influence of UVR on the photosynthetic apparatus. It seems that UVR should activate photoprotective mechanisms. In addition, we observed higher content of UV absorbing compounds in methanolic extracts of UV treated plants. 7 different phenolic substances (phenolic acid derivates, luteolin derivate and apigenin derivates) were detected and separated by HPLC-DAD whereas the major UV absorbing compound was most likely saponarin.

Keywords

Fenolické látky, fenolické kyseliny, hydroxyskořicové kyseliny, flavonoidy, fotosyntetické pigmenty, xantofylový cyklus, UV-stínění, ultrafialové záření, HPLC, UV-VIS spektrofotometrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 6. 2009

Identifier: 9733

Thesis defence

• Date of defence: 20. 8. 2009
• Supervisor: Doc. RNDr. Jiří Kalina, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Applied Physics / Biophysics