Strukturní a temporální analýza replikace fágů v biofilmu

Ing. Lucie Valentová, Ph.D.

Disertační práce

Structural and time-resolved studies of phage replication in bacterial biofilm

Anotace:

S rostoucím počtem infekcí způsobených bakteriemi rezistentními vůči antibiotikům narůstá zájem o bakteriofágy a fágovou terapii. Možnost využití fágů a produktů od nich odvozených je limitována nedostatečnými znalostmi interakcí mezi fágem a bakterií. Tato práce se zabývá strukturou virionu sifofága JBD30 (rod Casadabanvirus) a jeho replikací v buňce a biofilmu bakterie P. aeruginosa. Struktura virionu, prázdné částice, prokapsidy a virionu fága JBD30 navázaného na receptor, kterým je pilus typu IV, byla vyřešena pomocí kryo-elektronové mikroskopie metodou jednočásticové analýzy (Single particle analysis). Kombinace kryo-elektronové tomografie a superrezoluční fluorescenční mikroskopie umožnila popis klíčových stádií replikačního cyklu fága JBD30 začínajícího rozpoznáním hostitelské buňky a doručením fágového genomu, a končícího uvolněním nových virionů. Pro kultivaci biofilmu bakterie P. aeruginosa a pro sledování postupu fágové infekce napříč biofilmem byl použit Light-sheet fluorescenční mikroskop vybavený unikátním průtokovým systémem. Pro účely fluorescenční mikroskopie byl připraven mutant fága JBD30 značený modrým fluorescenčním proteinem navázaným na C-konec hlavního kapsidového proteinu. Buňky bakterie P. aeruginosa byly transformovány plasmidy zajištujícími stálou expresi zeleného a červeného fluorescenčního proteinu. Výsledky práce vedly k vytvoření detailního strukturně a časově rozlišeného modelu interakce fága JBD30 s bakterií P. aeruginosa. Struktury proteinů a zde popsaný replikační mechanismus jsou pravděpodobně konzervovány u všech sifofágů, které jako primární receptor využívají bakteriální pilus typu IV. Pochopení replikačního mechanismu, identifikace klíčových proteinů určených pro rozpoznání hostitelské buňky a translokaci fágového genomu, a jejich strukturní charakterizace umožní racionální design fágů a jejich derivátů cílených na konkrétní patogenní bakterie.

Abstract:

Bacteriophages and phage therapy are getting more attention as the numbers of the infections caused by multidrug resistant bacteria increase. However, the usage of phages and phage derived products is limited due to the lack of knowledge about phage-bacterium interactions. In this thesis, the virion structure and the replication mechanism of Casadabanvirus siphophage JBD30 in a single P. aeruginosa cell, as well as in the context of P. aeruginosa biofilm was studied. The structure of JBD30 virion, empty particle, procapsid and a virion attached to its receptor, P. aeruginosa type IV pilus, were resolved using the cryo-electron microscopy single particle analysis approach. The combination of cryo-electron tomography and super-resolution fluorescence imaging enabled description of key stages of JBD30 replication cycle starting with the recognition of the host cell and genome delivery, and ending with a release of new phage progeny. Light-sheet fluorescence microscope equipped with a unique flow-cell system was used for P. aeruginosa biofilm cultivation and time-lapse monitoring of JBD30 dissemination through the grown biofilm. For the purpose of the fluorescence microscopy a mutant of phage JBD30 with cyan fluorescent protein fused to the C-terminus of major capsid protein was prepared using a yeast-based phage-engineering platform. P. aeruginosa cells were labelled using plasmids ensuring stable expression of green and red fluorescent proteins. Results of the thesis enabled me to propose a detailed time-resolved structural model of phage JBD30 – P. aeruginosa interaction. It is likely that the structural features and replication mechanisms described here for bacteriophage JBD30 are conserved among siphophages that utilize type IV pilus as an initial receptor. The understanding of phage replication mechanism, identification of key proteins involved in the host cell recognition and genome delivery, and their structural characterization will enable rational design of phage mutants and derivatives efficient in targeting specific pathogenic bacteria.

Keywords

bakteriofág, Casadabanvirus JBD30, Pseudomonas aeruginosa, biofilm, interakce fág-bakterie, kryo-elektronová mikroskopie, jednočásticová analýza, kryo-elektronová tomografie, superrezoluční fluorescenční mikroskopie. bacteriophage, phage-bacterium interaction, cryo-electron microscopy, single particle analysis, cryo-electron tomography, fluorescent microscopy

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 9. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 24. 9. 2024
• Vedoucí: doc. Mgr. Pavel Plevka, Ph.D.
• Oponent: prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc., RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D., Dr. Cécile Breyton

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Vědy o živé přírodě / Vědy o živé přírodě