Deregulace buněčné proliferace a apoptózy jako důsledek působení polyaromatických látek

Mgr. Jiřina Procházková, Ph.D.

Doctoral thesis

Deregulation of cell proliferation and apoptosis by xenobiotics and cytostatics

Abstract:

Díky mohutnému rozvoji průmyslu během minulého století bylo naše životní prostředí znečištěno různými chemickými látkami. Za hlavní zdroje znečistění povrchové a pitné vody, říčních sedimentů, půdy i vzduchu lze považovat především procesy spojené s nedokonalým spalováním organických materiálů nebo také produkcí pesticidů, herbicidů, nátěrových a lepících hmot apod. Typickým příkladem environmentálního toxikantu se stal 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), známý především díky ekologické havárii v italském městě Seveso. Tato látka je velmi silným nádorovým promotorem a působí mimo jiné toxicky na kožní, nervový, imunitní či reprodukční systém a výrazně se podílí na deregulaci metabolismu tuků. Vzhledem k faktu, že TCDD způsobuje u člověka a zvířat vývoj nejrůznějších nádorových onemocnění, především jater a plic, byl označen komisemi IARC a WHO jako lidský karcinogen třídy 1. Na buněčné úrovni jsou efekty TCDD zprostředkovány především pomocí transkripčního faktoru AhR, jehož funkce je spjata s regulací metabolismu xenobiotik a genové exprese enzymů cytochromu P450. Mimo to, toxicita dalších exogenních látek jako jsou PAHy a PCB je také zprostředkována Ah receptorem. Ligandy AhR však mohou být i různé přírodní látky jako jsou např. flavonoidy, které se mohou chovat nejen jako jeho agonisté ale také jako antagonisté. Protože všechny zmíněné látky představují exogenní ligandy AhR spekuluje se také o existenci tzv. endogenních ligandů (např. indigoidy nebo metabolity tryptofanu), což částečně přispívá k vysvětlení role AhR během vývoje a při udržení buněčné homeostáze. Předkládaná práce si klade za cíl charakterizovat signální dráhu AhR v buněčné linii WB-F344, která představuje in vitro model jaterních oválných buněk. Především jsme se zabývali studiem role AhR ve fenoménu kontaktní inhibice, a to s ohledem na studium mechanismů zahrnutých v nádorové promoci jaterní tkáně. Z tohoto důvodu jsme vybrali chemické látky představující odlišné skupiny ligandů AhR: i) toxické exogenní ligandy TCDD a PCB126; ii) syntetické flavonoidy, z nichž -naphthoflavone (BNF) představuje model agonistického ligandu AhR a 3´-methoxy-4´-nitroflavonu (3M4NF), který představuje model antagonistického ligandu AhR; a iii) hypotetický endogenní ligand AhR, indirubin. Mezi zásadní patří zjištění, že oba syntetické flavony BNF a 3M4NF, podobně jako TCDD či PCB126, indukují proliferaci a progresi buněčného cyklu buněk WB-F344 nacházejících se v kontaktní inhibici, což je spojeno s posílenou expresí Cyklinu A. Indirubin naproti tomu neměl žádný vliv na proliferaci buněk WB-F344. Dále byla testována schopnost PCB126, BNF, 3M4NF a indirubinu aktivovat AhR signalizaci v buňkách WB-F344 a srovnat ji s aktivačním potenciálem TCDD (sledovanými parametry mj. byli: buněčná lokalizace AhR, interakce AhR s DNA, exprese genů kódujících enzymy cytochromu P450 a jiných cílových genů AhR). Oba modelové flavony navíc ve zmíněné buněčné linii modulovali efekty TCDD a indukovali expresi cílových genů AhR (Cyp1a1, Cyp1b1, Cdh13, Nqo1). Ačkoli indirubin indukoval translokaci i degradaci AhR, nedetekovali jsme žádné změny v expresi výše zmíněných genů, což může naznačovat existenci odlišné genové baterie, která je pravděpodobně regulována AhR aktivovaným endogenními ligandy. V druhé části studie jsme se zabývali objasňováním role AhR v deregulaci kontaktní inhibice a kontroly buněčného cyklu. Pro tento účel jsme využili jednak WB-F344 buněk, kterým byl pomocí metod genového inženýrství odstraněn AhR nebo ARNT, dále WB-F344 buněk s potlačenou expresí AhR pomocí RNA interference a také buněk odvozených z krysího hepatomu, které exprimo

Abstract:

valy (5L) či nikoli (BP8) AhR. Podařilo se nám prokázat, že TCDD i PCB126 indukují ztrátu kontaktní inhibice a to mechanismem, který je závislý na přítomnosti funkčního AhR, ale nezávislý na ARNT. Takto indukovaná deregulace kontaktní inhibice je také spojena s modulací genové exprese a buněčné lokalizace proteinů (beta-catenin, plakoglobin, E-cadherin, T-cadherin), které jsou přítomny v adherentním či desmosomálním typu mezibuněčného spojení. Oba modelové flavony se také ukázali být účinnými modulátory mezibuněčné komunikace zprostředkované kadheriny a kateniny. Závěrem můžeme říci, že předkládaná studie částečně objasňuje roli signální dráhy AhR v charakteristických procesech karcinogeneze tj. v deregulaci buněčného cyklu, kontaktní inhibice a mezibuněčné komunikace, v modelu jaterních progenitorových buněk.

Abstract:

Due to the massive industrial development occurring during the last century, various chemical compounds and xenobiotics have been produced and widely distributed in the environment. The production of pesticides, herbicides, painting colours and/or various adhesives, or imperfect combustion processes, are only a part of sources of numerous aromatic contaminants, commonly found in surface and fresh water, river sediments, soil and/or air. One of the notorious environmental toxicants, made infamous during the ´Seveso´ incident, is 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), a highly potent tumor promoter, which has been shown to induce reproductive and skin toxicity, neurotoxicity, immunotoxicity and to deregulate lipid metabolism. Apart from these negative effects observed both in humans and in animals, the development of tumors in different target tissues, especially in the liver or lungs, has led international authorities, such as the IARC and WHO, to list TCDD as a group 1 human carcinogen. At the cellular level, the major part of TCDD effects are seemingly mediated predominantly through AhR activation, which is generally associated with xenobiotic metabolism via regulation of cytochrome P450 enzymes expression. AhR is also a known mediator of toxicities induced by exogenous compounds, including PAHs or PCBs. Additionally, many natural compounds, such as flavonoids, may behave as AhR agonists and/or antagonists. Several compounds, such as indigoids or tryptophan metabolites have been speculated to act as hypothetical endogenous AhR ligands, thus indicating the physiological role of AhR in development and maintenance of homeostasis. The present study aimed to characterize AhR signaling in WB-F344 cells, an in vitro model of oval liver ´stem-like´cells. Our principal goal was to study the role of AhR in the phenomenon of contact-inhibition with respect to mechanisms being involved in liver tumor promotion. Therefore, we chose specific chemical compounds, representing different classes of AhR ligands: i) known exogenous toxic AhR agonists TCDD and PCB126; ii) model synthetic flavonoids acting in agonistic and/or antagonistic manner - -naphthoflavone (BNF) and 3´-methoxy-4´-nitroflavone (3M4NF); and iii) a hypothetical endogenous AhR ligand indirubin. Among other principal findings, our results suggest that, similar to TCDD and PCB126, both synthetic flavones BNF and 3M4NF induce cell proliferation and cell cycle progression of contact-inhibited WB-F344 cells, accompanied with enhanced Cyclin A expression. In contrast to that, indirubin has no effect on proliferation of WB-F344 cells. The ability of PCB126, BNF, 3M4NF and indirubin to activate AhR signaling in WB-F344 cells (AhR cellular localization, AhR-DNA interaction, CYPs and other AhR-target gene expression) has been tested and compared with the effects of TCDD. Futhermore, both flavones have been shown to modulate TCDD responses in these cells and to induce expression of AhR-target genes (Cyp1a1, Cyp1b1, Cdh13, Nqo1). Although AhR translocation and degradation has been shown to be induced also by the potential endogenous ligand indirubin, we did not detected any changes in expression of genes induced by exogenous ligands of AhR, thus indicating possible existence of other gene battery being regulated by AhR upon its activation by endogenous ligands. The second part of this study aimed to investigate the role of AhR in deregulation of contact-inhibition and cell cycle control. For this purpose we used WB-F344 variants with knockout AhR or ARNT, WB-F344 cells with AhR downregulated by shRNA or siRNA and rat hepatoma cells expressing (5L) or deficient for AhR (BP8). We have shown, that TCDD and PCB126 are inducers of AhR-dependent, but ARNT-independent loss of contact inhibition, which probably involves deregulation of gene expression and cellular localization of proteins involved in adherens and desmosomal junctions such as beta-catenin, plakoglobin, E-cadherin and

Abstract:

T-cadherin. Both model flavones have been also shown to be potent modulators of cell-to-cell communication mediated by cadherins and catenins. Taken together, the present study suggests a significant role of AhR activation in deregulation of cell cycle, contact inhibition and cell-to-cell communication in model of liver progenitor cells, all being characteristic features commonly targeted during carcinogenesis.

Keywords

AhR, aryl hydrocarbon receptor, flavones, TCDD, 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, indirubin, cell proliferation, contact inhibition, cell-to-cell communication AhR, arylhydrokarbonový receptor, flavony, buněčná proliferace, kontaktní inhibice, mezibuněčná komunikace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 6. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 17. 6. 2008
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Zdeněk Dvořák, Ph.D., doc. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology