Analýzy amplifikace genu ERBB2 u karcinomu prsu

Bc. Lucie Charvátová

Master's thesis

Analysis of the ERBB2 gene amplification in breast carcinoma

Abstract:

Amplifikace nebo nadměrná exprese genu ERBB2, který kóduje tyrosinkinázový receptor ErbB2, je jedním z molekulárních markerů stanovovaných u pacientek s karcinomem prsu. Představuje negativní prognostický faktor a současně předpovídá citlivost onemocnění na léčbu cílenou na receptor ErbB2. V rutinní praxi je status ERBB2 stanovován nejčastěji pomocí imunohistochemického barvení (IHC) a/nebo metody fluorescenční hybridizace in situ (FISH). Cílem diplomové práce bylo zhodnotit použití chromogenní hybridizace in situ (CISH) a kvantitativní polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí (RT-qPCR) pro stanovení statusu genu ERBB2 a posoudit jejich výhody a nevýhody. To bylo provedeno analýzou 36 vzorků RNA z FFPE (fixovaných formalínem a zalitých v parafínu) bloků, které byly již dříve analyzovány rutinními metodami v laboratoři molekulární patologie na Ústavu patologie Fakultní nemocnice Brno. 25 vzorků bylo testováno metodou CISH a 18 vzorků metodou RT qPCR. Za účelem zhodnocení degradace RNA ve FFPE blocích byla provedena elektroforetická separace vzorků RNA v gelu MOPS a analýza přístrojem Agilent 2100 Bioanalyzer. Pro potvrzení funkčnosti metody RT-qPCR bylo analyzováno také 6 vzorků nádorů uložených v roztoku RNAlater. Obě testované metody lze použít ke stanovení statusu genu ERBB2 u karcinomu prsu. CISH nabízí výhody jako je nízká cena, nízké nároky na přístrojové vybavení a skladování vzorků a příjemnější podmínky odečítání výsledků ve srovnání s FISH. Nevýhodou CISH je horší rozlišení jednotlivých signálů. Výhodou RT-qPCR je nízké riziko subjektivity při hodnocení. Významnou nevýhodou této metody je značná degradace RNA ve FFPE blocích, které jsou nejčastějším zdrojem materiálu pro rutinní analýzy.

Abstract:

Amplification or overexpression of the ERBB2 gene, which encodes the tyrosine kinase receptor ErbB2, is one of the molecular markers determined in breast cancer patients. It represents a negative prognostic factor and it predicts responsiveness of the disease to the therapy targeted to ErbB2 receptor as well. In clinical practice, the ERBB2 status is routinely assessed by immunohistochemical staining (IHC) and/or fluorescence in situ hybridization (FISH). The aim of this diploma thesis was to explore the use of chromogenic in situ hybridization (CISH) and quantitative polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-qPCR) for the ERBB2 gene status assessment and to evaluate their advantages and disadvantages. This was performed by analysis of 36 RNA samples from FFPE (formalin fixed paraffin-embedded) blocks previously analyzed in the laboratory of molecular pathology at the Department of Pathology of University Hospital Brno by routine methods. 25 samples were analyzed by CISH and 18 samples by RT-qPCR. Electrophoretic separation of the RNA samples on MOPS gel and analysis by Agilent 2100 Bioanalyzer instrument were performed for evaluation of RNA degradation in FFPE blocks. To confirm the functionality of RT-qPCR method, 6 tumor samples stored in RNA later were also analyzed. Both of the tested methods can be used for ERBB2 gene status assessment in breast cancer. CISH offers advantages such as low price, low requirements on laboratory equipment and storage, and more pleasant conditions of the results assessment, compared to FISH. A disadvantage of CISH is a worse resolution of individual signals. An advantage of RT qPCR is a low risk of subjectivity of the results evaluation. The most significant disadvantage of this method is extensive degradation of the RNA from FFPE blocks that are the most frequent source of material for routine analyses.

Keywords

karcinom prsu, ERBB2, HER2, HER-2/neu, CISH, RT-qPCR, ověření kvality RNA, breast cancer, RNA quality assessment

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2018
• Supervisor: prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
• Reader: Mgr. Eva Ondroušková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Medical Genetics and Molecular Diagnostics