Cílená řízená evoluce halogenalkandehalogenázy DhaA směrem k zvýšení aktivity s 1,2-dichloretanem

Bc. Pavel Dvořák, Ph.D.

Master's thesis

Focused directed evolution of haloalkane dehalogenase DhaA towards increased activity with 1,2-dichloroethane

Anotácia:

Diplomová práce je věnována tématu modifikace aktivity bakteriálního enzymu halogenalkandehalogenázy DhaA z Rhodococcus erythropolis Y2 s halogenovaným uhlovodíkem 1,2-dichloretanem za využití progresivního přístupu proteinového inženýrství známého jako cílená řízená evoluce. V teoretickém úvodu práce je čtenáři přiblížena problematika výskytu halogenovaných uhlovodíků v životním prostředí. Zvláštní pozornost je věnována syntetickému toxickému polutantu 1,2-dichloretanu. Druhá část úvodu je zaměřena na popis bakteriálních enzymů halogenalkandehalogenáz, především pak dehalogenáz DhlA z Xanthobacter autothropicus GJ10 a DhaA z R..erythropolis Y2, které jsou schopny nebezpečné halogenované sloučeniny degradovat na sloučeniny méně škodlivé či neškodné jednoduchou dehalogenační reakcí. Aktivita těchto enzymů s halogenovanými substráty však často není dostatečná pro jejich využití v praktických aplikacích. Možné řešení nabízí proteinové inženýrství a jeho moderní přístup cílené řízené evoluce, která je definována v poslední části úvodu. Přirozená aktivita dehalogenázy DhaA s problematickým substrátem 1,2-dichloretanem je zcela minimální. Cílem experimentální části diplomové práce bylo pokusit se zlepšit aktivitu DhaA s 1,2-dichloretanem za využití jedné z metod cílené řízené evoluce - saturační mutageneze. V experimentální části práce je popsán výběr vhodného templátu a aminokyselinových reziduí pro mutagenezi, konstrukce a skrínink knihoven genových mutantů a biochemická charakterizace vyselektovaných mutantních proteinů. Význam konkrétních změn ve struktuře enzymu DhaA, které vedly ke konečnému dvanáctinásobnému navýšení aktivity enzymu s 1,2-dichloretanem, je diskutován v závěru práce.

Abstract:

This Diploma Thesis is dedicated to the topic of modification of the bacterial enzyme haloalkane dehalogenase DhaA from Rhodococcus erythropolis Y2 towards increased activity with halogenated hydrocarbon 1,2-dichloroethane using progressive approach of protein engineering – focused directed evolution. The problems of halogenated hydrocarbons occuring in the environment are discussed in the theoretical part of the Thesis. The emphasis is put on the synthetic toxic pollutant 1,2-dichloroethane. Bacterial enzymes haloalkane dehalogenases, particularly DhlA from Xanthobacter autothropicus GJ10 and DhaA from R..erythropolis Y2, and their ability to degrade halogenated compounds using simple dehalogenation reaction are discussed in the second part of the introduction. The activity of these enzymes with halogenated substrates is often to low to allow their practical applications in bioremediation or other biotechnological processes. This problem can be solved by protein engineering and its modern approach of focused directed evolution, which is defined in the last part of the Introduction. The activity of wild-type dehalogenase DhaA with problematic substrate 1,2-dichloroethane is very low. The experimental part of the Thesis is aimed at the improvement of the DhaA activity with 1,2-dichloroethane. Saturation mutagenesis was used for this purpose as one of the methods of focused directed evolution. The experimetal part of the Thesis describes the selection of an appropriate template and selection of amino acid residues for mutagenesis, construction and screening of mutant libraries, and biochemical characterization of selected mutant proteins. The significance of certain changes in DhaA structure which led to the final twelfe-times improvement of DhaA activity with 1,2-dichloroethane is summarized in the Discussion part of the Thesis.

Keywords

halogenalkandehalogenázy, halogenované uhlovodíky, 1, 2-dichloretan, proteinové inženýrství, cílená řízená evoluce, halogenalkan dehalogenases, halogenated hydrocarbons, 2-dichloroethane, protein engineering, focused directed evolution

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 6. 2009
• Vedúci: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biology / Molecular Biology and Genetics