Reprogramming of human skin fibroblasts into functional cardiomyocytes - insights into molecular pathology of CPVT disorder

Ivana Aćimović, M.Sc.

Doctoral thesis

Abstract:

Pozadí: Katecholaminergní polymorfní komorová tachykardie (CPVT) je vysoce letální, dědičná arytmogenní porucha, vyskytující se bez strukturního poškození srdce. Nejčastěji je způsobena mutacemi v genu pro srdeční ryanodinový receptor (RYR2). Existují návrhy, že přestavba mutantního RyR2 makromolekulárního komplexu vede k úniku vápenatých iontů (Ca2+) ze sarkoplasmatického retikula (SR), nicméně přesný mechanismus CPVT není zatím znám. Lidské pluripotentní kmenové buňky (hPSCs), mezi které patří lidské embryonální a indukovaní pluripotentní kmenové buňky (hESCs a hiPSCs) a jejich diferenciace do kardiomyocytů (CMs) nabízejí unikátní příležitost pro modelování chorob a testování léčiv. Metody: Dermální fibroblasty získané od ženy s CPVT nesoucí novou mutaci RyR2-D3638A byly přeprogramovány do hiPSCs pomocí lentivirového vektoru STEMCCA. Buněčné linie hESC (CCTL12, -13 a -14) a hiPSC (hiPSC clone 4, UEFhfiPS1.4 a CPVT) byly použity pro diferenciaci do kardiomyocytů. Zachování mutace RyR2-D3638A v linii CPVT-hiPSCs bylo potvrzeno HRM analýzou a sekvenováním. Výskyt specifických markerů v hPSCs a hPSC-CMs bylo potvrzeno pomocí immunocytochemie, semikvantitativní RT-PCR a qRT-PCR. Mikroskopie atomárních sil (AFM), patch clamp a metody vizualizace Ca2+ byly použity pro studium funkčních vlastností embryoidních tělísek (EB) a CMs (derivovaných z hPSC) v klidovém stavu a po ošetření léčivy. Výsledky: CPVT dermální fibroblasty byly úspěšně přeprogramovány do CPVT-hiPSCs, což bylo prokázáno expresí pluripotenčních markerů a diferenciací do EB. Mezi několika hPSCs liniemi byla odhalena meziliniová variabilita v potenciálu diferencovat do kardiomyocytů. hPSC-CMs byly funkční, nicméně měly převážně fetální charakteristiku. CPVT-hiPSC-CMs (CPVT-CMs) vykazovaly abnormální stresem indukované kontraktilní a elektrofyziologické vlastnosti spolu s únikem Ca2+ ze SR. CPVT-CMs vykazovaly neadekvátní odpovědi na metoprolol, a flecainid na ně měl pozitivní vliv v souladu s klinickým pozorováním. Zlepšení funkčních vlastností CPVT-CMs pomocí rycal S107 naznačilo, že mutace RyR2-D3638A pravděpodobně vedla ke strukturním změnám RyR2, stresem indukované přestavbě makromolekulárního komplexu RyR2 a depleci jeho stabilizačního proteinu FKBP12.6. Závěr: Nová mutace RyR2-3638A způsobuje přestavbu makromolekulárního komplexu RyR2 a abnormální biofyzikální vlastnosti CPVT-CMs připomínající klinická pozorování. To ukazuje, že hPSC-CMs jsou vhodné pro modelování chorob a testování léčiv, což nás posouvá o krok blíže personalizované medicíně.

Abstract:

Background: Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) is a highly lethal inherited arrhythmogenic disorder occurring in the absence of a structural heart disease. Predominantly it is caused by the mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (RYR2). There are implications that RyR2 macromolecular complex remodeling leads to sarcoplasmic reticulum (SR) calcium (Ca2+) leakage. However, underlying mechanism of CPVT is still unclear. Human pluripotent stem cells (hPSCs), including human embryonic and induced pluripotent stem cells (hESCs and hiPSCs, respectively), and their differentiation into cardiomyocytes (CMs) offer a unique opportunity for disease modeling and drug testing. Methods: Dermal fibroblasts from a female CPVT patient carrying a novel RyR2-D3638A mutation were reprogrammed into hiPSCs by STEMCCA lentiviral vector. hESC (CCTL12, -13, and -14) and hiPSC (hiPSC clone 4, UEFhfiPS1.4, and CPVT) lines were used for cardiac differentiation. Preservation of the RyR2-D3638A mutation in CPVT-hiPSCs was confirmed by HRM analysis and sequencing. Presence of specific markers in hPSCs and hPSC-CMs was shown by immunocytochemistry, semiquantitative RT-PCR, and qRT-PCR. Atomic force microscopy (AFM), patch clamp, and Ca2+ imaging technique were used for studying the functional properties of hPSC-derived embryoid bodies (EBs) and CMs at rest and under drug treatment. Results: CPVT dermal fibroblasts were successfully reprogrammed into CPVT-hiPSCs as shown by expression of pluripotency markers and EB differentiation. Interline variability in cardiac differentiation potential of multiple hPSC lines was revealed. hPSC-CMs were functional, although with mainly fetal-like features. CPVT-hiPSC-CMs (CPVT-CMs) showed abnormal stress-induced contractile and electrophysiological properties in line with SR Ca2+ leakage. There was inadequate response to metoprolol and positive effect of flecainide on CPVT-CMs that corresponded to the clinical observation. A rycal S107 improved functional properties of CPVT-CMs, indicating that the RyR2-D3638A mutation probably led to RyR2 structural alterations, stress-induced RyR2 macromolecular complex remodeling, and depletion of its stabilizing protein FKBP12.6. Conclusions: The novel RyR2-D3638A mutation causes RyR2 macromolecular complex remodeling and abnormal biophysical properties of CPVT-CMs resembling the clinical observations. It shows that hPSC-CMs are suitable for disease modeling and drug testing that brings us a step forward to the personalized medicine.

Keywords

CPVT, RyR2, embryoidní tělíska, kardiomyocyty derivované z hPSC, vápník, S107, embryoid body, hPSC-derived cardiomyocytes, calcium

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 8. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 20. 9. 2018
• Supervisor: prof. Ing. Petr Dvořák, CSc.
• Reader: doc. MUDr. Markéta Bébarová, Ph.D., Ph.D. Giancarlo Forte

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology