Analýza exprese vybraných regulačních faktorů chmelu v návaznosti na projevy viroidní patogeneze

Mgr. Zoltán FÜSSY

Diplomová práce

Expression analysis of selected regulation factors in hop with relation to symptoms of viroid pathogenesis

Anotace:

Cílem práce bylo zjistit, zda dochází u rostlin infikovaných viroidem kromě změn morfogeneze a metabolomu také ke změnám exprese známých chmelových transkripčních faktorů (TF). Z předchozích výzkumů bylo zjištěno zapojení zkoumaných TF, konkrétně faktorů HlMyb1, HlMyb3, HlbHLH, HlbZIPA a HlbZIP2, v regulaci produkce sekundárních metabolitů v hlávkách. Byly připraveny infekční vektory obsahující dimery dvou blízce příbuzných viroidů, HSVd ("hop stunt viroid") a CPFVd ("cucumber pale fruit viroid"). Pro infekci chmelu (Humulus lupulus L.) byla použita metoda biolistické inokulace mladých rév. Kvůli vysokému obsahu flavonoidů v listech byl pro pokusy vybrán kultivar Admiral. Infekce chmelu oběma druhy viroidů byla potvrzena pomocí "Northern" hybridizace a dot blotu. Rostliny infikované viroidem HSVd vykazovaly silné symptomy, zakrslost, epinastie a tuhost listů. Zajímavým pozorováním bylo odbarvení řapíků u rostlin infikovaných viroidem HSVd, zřejmě kvůli zastavení produkce anthokyanů. Podobné symptomy byly pozorovány také u rostlin infikovaných CPFVd, nicméně nebyly tak intenzivní. U symptomatických rostlin byla provedena analýza HPLC, při které byla oproti kontrolním rostlinám porovnávána změna hladin flavonolových glykozidů, fenolických kyselin, hořkých kyselin a xanthohumolu. V listech a řapících HSVd-infikovaných rostlin byl pozorován signifikantní pokles obsahu flavonolových glykozidů a fenolických kyselin. Na druhou stranu byl u pletiv infikovaných HSVd pozorován nárůst obsahu xanthohumolu a hořkých kyselin ve srovnání se zdravou kontrolou. Na rozdíl od HSVd byl u rostlin infikovaných CPFVd zjištěn pokles obsahu všech zkoumanách sekundárních metabolitů. Tento rozdíl naznačuje odlišnou odpověď metabolické dráhy hostitelské rostliny na patogenezi viroidů CPFVd a HSVd. Pro semikvantitativní stanovení hladin TF u kontrolních a infikovaných pletiv byla použita metoda RT-PCR. Pro kvantitativní stanovení mRNA předpokládaných TF HlbZIPA a HlbZIP2 v pletivu řapíků rostlin infikovaných HSVd byla použita analýza RealTime RT-PCR. Byla zjištěná zvýšená hladina mRNA faktorů bZIP u infikovaného materiálu, což naznačuje zapojení těchto faktorů v odpovědi hostitelské rostliny na infekci HSVd. Pomocí termodynamických metod TGGE a analýzy heteroduplexů byly identifikovány sekvenční varianty HlbZIP2. Dle porovnání sekvence aminokyselin HlbZIP2 s databankou známých proteinů, patří tento předpokládaný TF do skupiny proteinů bZIP se zapojením signalizace stresu a ABA u A. thaliana.

Abstract:

The aim of this work was to determine whether there are besides morphogenetic and metabolomic changes in viroid-infected plants also some alterations in the expression of transcription factors (TFs) known from our previous work to be involved in the secondary metabolites production, namely HlMyb1, HlMyb3, HlbHLH, HlbZIPA and HlbZIP2 TFs. Infectious vectors were prepared containing dimers of two closely related viroids- hop stunt viroid (HSVd) and cucumber pale fruit viroid (CPFVd). To achieve infection of hop (Humulus lupulus L.), biolistic inoculation of young shoots was performed. Hop cv. Admiral was chosen as a model for our experiments, because of its high flavonoid content in leaves. Infection of hop with both of these viroid species was proven by means of Northern hybridization and dot-blot techniques. Plants infected with HSVd showed serious symptoms such as stunted growth, epinasty and rugosity of leaves. Interestingly, decoloration of the petioles of the plants infected with HSVd was observed, maybe as a result of lower anthocyanins production. These symptoms were similar but milder in CPFVd-infected hops. On plants bearing symptoms, HPLC analyses were performed and compared to controls to detect changes in the levels of flavonol glycosides, phenolic acids, bitter acids and xanthohumol. In HSVd-infected hop leaves and petioles, significant decrease in the contents of flavonol glycosides and phenolic acids was observed. On the other hand, an increase in the amount of xanthohumol and bitter acids was detected in HSVd-infected tissues compared to healthy controls. Unlike to HSVd infection, the decrease of all analyzed secondary metabolites was observed in CPFVd-infected material. This difference suggests an alternative response of metabolome pathways to CPFVd-caused pathogenesis in comparison to HSVd. Semiquantitative RT PCR was performed to assay levels of TFs in healthy and infected hop tissues. Quantitative RealTime analyses of putative hop transcription factors HlbZIPA and HlbZIP2 were carried out using RNA isolated from HSVd-infected petioles. Increased mRNA levels of bZIP TFs were detected in infected material, suggesting an involvement of these factors in the response of the host plants to HSVd infection. Using thermodynamic methods of TGGE and heteroduplex analysis, several sequence variants of HlbZIP2 were idetified. According to aminoacid sequence alignment, this putative factor belongs to a group of bZIP proteins known for ABA/stress signalling in A. thaliana.

Klíčová slova

transkripční faktory, flavonoidy, viroid, HSVd, CPFVd, biolistická infekce, TGGE

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 4. 2008

Zveřejnit od: 30. 4. 2008

Identifikátor: 7502

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2008
• Vedoucí: RNDr. Jaroslav Matoušek, CSc.

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Experimentální biologie