Porovnání ionizačních metod pro analýzu peptidu apidaecinu ve spojení s hmotnostně spektrometrickými metodami ve tkáních včel

Jakub SAVARA

Bakalářská práce

Comparison of ionization methods for analysis of apidaecin peptide with mass spectrometric techniques in bee tissues.

Anotace:

Antimikrobiální peptidy jsou velmi důležitou součástí humorální imunity živočichů včetně hmyzu. Jedním z významných antimikrobiálních peptidů včel (Apis mellifera) je peptid apidaecin, který se vyskytuje v jejich hemolymfě a tkáních. Apidaeciny jsou lineární peptidy bohaté na prolin vykazující aktivitu vůči Gram-negativním bakteriím. Cílem práce bylo ověřit možnost kvantifikace apidaecinu 1 ve spojení s MALDI ionizací a analyzátorem doby letu (TOF), což by umožnilo výrazně rychlejší a levnější hmotnostně-spektrometrickou analýzu velkého množství vzorků včel. Praktická část práce byla zaměřena na purifikaci a kvantifikaci apidaecinu 1 pomocí extrakce na pevné fázi se sorbentem WCX OasisTM, následované odsolením na C8 reverzní fázi a kvantifikací pomocí MALDI-TOF. Naměřená data ukázala, že lze dosáhnout lineární kalibrační závislosti poměru signálů apidaecinu 1 versus vhodný isotopově značený interní standard [13C615N4] apidaecin 1 a to v rozsahu 0,1 2,5 pmol apidaecinu 1 v různých biologických matricích (hemolymfa včel, homogenáty hrudníků). Dále byla pozorována výborná reprodukovatelnost stanovení poměru signálů při MALDI ionizaci vzorků analyzovaných z jednoho spotu i z různých spotů na MALDI desce. První kvantitativní data získaná analýzou reálných vzorků s přídavky standardu apidaecinu 1 ukázala dobrou návratnost stanovení peptidu v rozsahu 80-100 % s výbornou správností pohybující se v rozsahu 6-15 % v závislosti na množství přidaného apidaecinu 1. Srovnávací analýza kvantifikace apidaecinu 1 ve vzorcích pomocí MALDI-TOF a LC-ESI-MS analýzy ukázala srovnatelnou schopnost správného stanovení studovaného peptidu v reálném vzorku, nicméně pro potvrzení této možnosti je třeba provést analýzu většího počtu vzorků.

Abstract:

Antimicrobial peptides are an important part of humoral immunity of the animals, including insects. Apidaecin is one of the significant antimicrobial peptides, which occurs in the hemolymph and tissues of the honey bee (Apis mellifera). Apidaecins are linear proline-rich peptides with activity against Gram-negative bacteria. The main aim of this thesis was to verify the possibility of quantifying of apidaecins in conjunction with MALDI ionization and time of flight (TOF) analyzer, which would allow significantly faster and cheaper mass spectrometry analysis of many bee samples. The practical part was focused on the purification and quantification of apidaecins 1 using solid phase extraction with the WCX OasisTM sorbent, followed by desalting on C8 reverse phase and quantification by MALDI-TOF. The measured data showed that it is possible to achieve a linear calibration curve ratio of signals of apidaecin 1 versus an appropriate isotopically labeled internal standard [13C615N4] apidaecin 1 in the range of 0.1 to 2.5 pmol of apidaecin 1 in different biological matrices (bee hemolymph, homogenates of thoraxes). It was also observed excellent reproducibility determining the ratio of signals during MALDI ionization of samples analyzed on one spot and between different spots on a MALDI plate. First quantitative data obtained from the analysis of real samples spiked with apidaecin 1 standard showed a good recovery of the peptide in the range 80-100% with an excellent accuracy ranging from 6 to 15% depending on the amount of added apidaecin 1. Comparative analysis of quantification apidaecin 1 in samples by MALDI-TOF and LC-ESI-MS analysis showed the ability to correct estimation of the studied peptide in a real sample, however, to confirm this possibility is necessary to analyze a larger number of samples.

Klíčová slova

apidaecin, antimikrobiální peptidy, včela medonosná, humorální imunita, MALDI-TOF

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2015

Zveřejnit od: 14. 5. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. René Lenobel, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie