Charakterizace hot5 mutantů u Arabidopsis

Anna GERYKOVÁ

Bachelor's thesis

Characterization of hot5 mutants in Arabidopsis

Abstract:

Předkládaná bakalářská práce je zaměřena zejména na studium a charakterizaci hot5 mutantů Arabidopsis kódujících S-nitrosoglutathionreduktasu (GSNOR), což je klíčový enzym regulace S-nitrosylace. Jedná se konkrétně o mutanty hot5 1 a hot5 3, vyznačující se chybnými alelami v genu At5g43940. Jejich mutace se projevují výměnou aminokyseliny v řetězci. U mutanta hot5 1 byla zjištěna mutace E283K a u mutanta hot5 3 mutace G288R. Mutantní gen s největší pravděpodobností destabilizuje smyčku AtGSNOR, což způsobuje snížení aktivity a defektivní termotoleranci. V rámci experimentální části práce byl chelatační chromatografií purifikován rekombinantní AtGSNOR WT a dva hot5 mutantní proteiny. Metodou SDS PAGE byla určena molekulová hmotnost monomeru okolo 45 kDa a za pomocí metody Western blot použitím anti-GSNOR protilátek byla provedena imunodetekce hot5 mutantů. Bylo stanoveno pH a teplotní optimum za pomocí substrátu S nitrosoglutathionu (GSNO), které vykazovalo mírné odchylky u hot5 mutantů oproti WT. Stanovení kinetických parametrů Km a Vlim bylo testováno se substrátem GSNO. Bylo stanoveno IC50 inhibitorů N6022 a glutationu (GSH) pro WT i hot5 mutanty.

Abstract:

The presented Bc. thesis is focused especially on the study and characterization of Arabidopsis hot5 mutants coding S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR), which is the most important enzyme regulating S-nitrosylation. Specifically hot5-1 and hot5-3 mutants which are characterized by faulty alleles in the At5g43940 gene. Their mutations are manifested by the exchange of amino acids in the chain. A mutation E283K was detected in the hot5-1 mutant and a mutation G288R was detected in the hot5-3 mutant. The mutant gene most likely produces destabilized fold of AtGSNOR, causing reduction of activity and defective thermotolerance. In the experimental part of the work recombinant AtGSNOR-WT and two hot5 mutant proteins were purified by chelation chromatography. Molecular weight of monomer (~ 45 kDa) was determined by SDS-PAGE and immunodetection of hot5 mutants using anti-GSNOR antibody by Western blot. PH and temperature optimum was determined using S nitrosoglutathione (GSNO) as a substrate, which showed slight deviations in hot5 mutants compared to WT. Determination of kinetic parameters Km and Vlim was tested using GSNO as the best substrate. IC50 was determined for inhibitors N6022 and glutathione (GSH) in WT and hot5 mutants.

Keywords

Arabidopsis, hot5-1 mutant, hot5-3 mutant, S-nitrosoglutathionreduktasa, enzymologie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Lucie Činčalová, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry