Modifikace bakteriálních a fágových genomů pomocí CRISPR-Cas10 systému

Bc. Anna Sobotková

Bachelor's thesis

Modification of bacterial and phage genomes using CRISPR/Cas10 system

Anotácia:

CRISPR-Cas10 je prokaryotický adaptivní imunitní systém, který umožňuje bakteriím bránit se proti infekci bakteriofágy. Tento systém obsahuje malé RNA molekuly a komplex proteinů, které zajišťují specifickou degradaci fágových a dalších cizorodých nukleových kyselin. Přirozeně se geny pro CRISPR-Cas10 vyskytují u Staphylococcus epidermis, ale zcela chybí u Staphylococcus aureus. Cílem této práce je použít systém CRISRP-Cas10 ve S. aureus pro přípravu fága 812/K1-420 exprimujícího fluorescenční protein. Značený fág bude použit ke studiu šíření fágové infekce v biofilmu. V teorerické části se práce zabývá biofilmem a jeho problematikou spojenou se zvýšenou rezistencí kmenů bakterií k antibiotikům, dále immunitním systémem CRISPR-Cas a jeho variantou CRISPR-Cas10 a nakonec na bakteriofágy a jejich užití v boji proti resistentním bakteriím. Praktická část popisuje strategii pro modifikaci genomu fága 812/K1-420 napadajícího S. aureus pomocí CRISPR-Cas10 systému. Vytvoření plazmidu obsahujícího spacer cilící na genom fága 812/K1-420 a donorovou sekvenci s genem pro fluorescenční protein k modifikaci genomu fága 812/K1-420. Následuje transformace těchto plazmidů do S. aureus a infekce bakteriofágem.

Abstract:

CRISPR-Cas10 is a prokaryotic adaptive immunity system that enables bacteria to resist phage infection. This system includes small guide RNA molecules and a protein complex that degrade phage and other foreign nucleic acids. CRISPR-Cas10 was discovered in Staphylococcus epidermis, however it is not present in Staphylococcus aureus. This thesis aim is to use CRISPR-Cas10 system in S. aureus for preparation of phage 812/K1-420 expressing the fluorescent proteins. Labelled phages will be used to the study of phage infection of biofilm. The theoretical of this thesis includes description of bacterial biofilm, problems caused by antibiotic-resistant bacteria, summary of the current knowledge of CRISPR-Cas system and its type CRISPR-Cas10, and the use of phages in the treatment of antibiotic-resistant bacterial infections. Experimental part describes genetic modification of phage 812/K1-420, attacking S. aureus, using CRISPR-Cas10 system. Plasmid containing spacer targeting phage 812/K1-420 and donor sequence coding fluorescent proteins for modification of phage 812/K1-420 genome was prepared. These plasmids were transformed into S. aureus cells, which were infected by bacteriophages.

Keywords

CRISPR/Cas10, bacteriophages, Staphylococcus aureus, biofilm, phage therapy

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 6. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 7. 2020
• Vedúci: Ph.D. Aygul Ishemgulova
• Oponent: Mgr. Martin Benešík, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry