Separace pigment-proteinových komplexů thylakoidních membrán nativními technikami

Bc. Kristina SVRČINOVÁ

Master's thesis

The native techniques for separation of pigment-protein complexes of thylakoid membranes

Abstract:

Tato diplomová práce je zaměřena na separaci pigment-proteinových komplexů (PPC) z thylakoidních membrán (tBM) chloroplastů ječmene setého, smrku ztepilého a huseníčku rolního pomocí bezbarvé nativní elektroforézy v gradientovém polyakrylamidovém gelu (CN-PAGE) a také pomocí ultracentrifugace v gradientu sacharózy. Pro úspěšnou a šetrnou separaci PPC tBM různých rostlinných druhů pomocí CN-PAGE byla nejprve stanovena optimální doba působení detergentu pro solubilizaci tBM a vhodný poměr detergent:celkové chlorofyly. Jako optimální byl pro ječmen setý a huseníček rolní zvolen poměr detergent:chlorofyly 20:1 a doba působení detergentu 5 minut. Pro smrk ztepilý byl jako optimální zvolen poměr detergent:chlorofyly 35:1 a doba působení detergentu 10 minut. Po stanovení těchto hodnot byla provedena separace PPC suspenzí tBM vystavených různým teplotám (20-60 °C po dobu 15 minut) pro vyhodnocení působení vysokoteplotního stresu na složení a stabilitu PPC různých rostlinných druhů. Nejvyšší teplotní stabilitu vykazovaly PPC smrku ztepilého. Podařilo se mi najít vhodný způsob solubilizace tBM a u všech rostlinných druhů separovat pomocí CN-PAGE superkomplexy fotosystému I (PSI) a fotosystému II (PSII), což je jeden ze znaků vypovídajícím o šetrnosti použité separační techniky. Dalšími separovanými PPC byly především PSI s dimerem PSII (PSI-PSIID), monomery PSII (PSIIM), světlosběrné komplexy PSII v trimerní (LHCIIt) a monomerní (LHCIIm) formě a volné pigmenty (FP). Další metodou, která byla použita pro separaci PPC tBM různých rostlinných druhů byla ultracentrifugace v gradientu sacharózy. Gradient sacharózy byl připraven jak pomocí metody zmražování a rozmražování, tak i pomocí gradientové míchačky. Separace PPC touto metodou však nebyla příliš úspěšná.

Abstract:

This thesis is focused on the separation of pigment-protein complexes (PPC) of thylakoid membranes (tBM) of chloroplasts of spring barley, Norway spruce and Arabidopsis using clear native electrophoresis in gradient polyacrylamide gel (CN-PAGE) and sucrose density gradient ultracentrifugation. Firstly, optimal time of detergent treatment for tBM solubilization and suitable ratio of detergent to total chlorophylls were established for successful and gentle separation of PPC of different plant species by CN-PAGE. As optimal was for barley and Arabidopsis selected ratio of detergent to chlorophylls 20:1 and optimal time of detergent treatment 5 minutes. For Norway spruce was ratio detergent to chlorophylls 35: 1 and time of detergent treatment 10 minutes selected as optimal. After determination of these values the study of effects of high temperature stress on the composition and stability of PPC of various plant species was performed on tBM exposed to different temperatures (20-60 °C for 15 minutes). The highest temperature stability showed PPC of Norway spruce. I managed to find a suitable method for the solubilization of tBM and separated supercomplexes of photosystem I (PSI) and photosystem II (PSII) of all plant species by CN-PAGE, which is indicator of mildness of used separation technique. Other separated PPC were mainly PSI with dimeric PSII (PSI-PSIID), monomers of PSII (PSIIM), light-harvesting complexes of photosystem II in trimeric (LHCIIt) and monomeric (LHCIIm) form and free pigments (FP). Ultracentrifugation with sucrose density gradient was another technique used for separation of PPC of various plant species. Sucrose gradient was prepared by the method of freezing and thawing, as well as by using gradient maker. The separation of PPC by this method was not very successful.

Keywords

Pigment-proteinové komplexy, solubilizace, nativní elektroforéza, CN-PAGE, ultracentrifugace, vysokoteplotní stres, ječmen setý, huseníček rolní, smrk ztepilý

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2015

Accessible from:: 27. 4. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 19. 5. 2015
• Supervisor: Mgr. Irena Kurasová, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology